第五章 工业微生物育种诱变剂

第五章 工业微生物育种诱变剂 本章内容： 本章内容：化学诱变剂 物理诱变剂 生物诱变剂

诱变：通过人为的方法，利用物理、化学因素处理微 诱变：通过人为的方法，利用物理、 诱变 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变 诱发突变。 生物以引起突变，这一过程称为诱发突变。诱发突变(induced mutation)的发现 诱发突变(induced mutation)的发现 1927年 射线诱发果蝇遗传性状变异。 1927年，Muller 用X射线诱发果蝇遗传性状变异。 在第二次世界大战中， 在第二次世界大战中，又发现化学物质氮芥也能导致细菌性状变异 陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。 陆续发现许多物理因子与化学物质都具有诱发基因突变的作用。

近年来，随着基因工程技术的不断发展， 近年来，随着基因工程技术的不断发展，蛋白质工程中点突变的重要技

诱变剂mutagen :凡是能诱发生物基因突变，且突变频率远 凡是能诱发生物基因突变， 诱变剂 诱变剂种类：化学诱变剂、 诱变剂种类：化学诱变剂、物理诱变剂和生物诱变剂

第一节 化学诱变剂

定义： 定义：一类能对DNA起作用，改变DNA结构，并引起遗传变异 化学诱变剂种类： 化学诱变剂种类：碱基类似物、碱基修饰剂、移码突变剂

一、碱基类似物 base

analogue

碱基类似物： 碱基类似物：是指其分子结构同DNA分子中的碱基非常类似 主要诱变剂：5-溴尿嘧啶(5-BU) /T 主要诱变剂 2-氨基嘌呤(2-AP) /A 诱发的突变：AT 诱发的突变1.

GC的转换 转换。 转换

2.

碱基类似物是如何提高突变频率的? 碱基类似物是如何提高突变频率的?

DNA复制过程中取代正常碱基 复制过程中取代正常碱基， 在DNA复制过程中取代正常碱基，整合进 DNA分子 DNA分子 它们产生异构体的频率高，出现碱基错配 它们产生异构体的频率高， 的概率也高

(一)碱基类似物的诱变机制——现以 现以5-BU为例来分析碱基类似物的诱变机制。当胸 为例来分析碱基类似物的诱变机制。 现以 为例来分析碱基类似物的诱变机制 腺嘧啶分子结构中5位碳原子上的甲基被溴( ) 腺嘧啶分子结构中 位碳原子上的甲基被溴(Br)原子取 位碳原子上的甲基被溴 的结构式。 代，就构成了5-BU的结构式。 就构成了 的结构式

5-溴尿嘧啶(5-BU)的结构 溴尿嘧啶( 溴尿嘧啶 )

5 溴 尿 嘧 啶 ( 5 ) 的 碱 基 配 对

-BU8

诱发的突变

5-BU掺入错误 掺入错误G≡ C

5-BU掺入后的复制错误 掺入后的复制错误A:T

G ≡ BUe G≡ C

G≡ C

A: BUk A:T

A:T G ≡ BUe

A=BUk

A=T

G ≡ BUe

G ≡C A: T → G ≡ C

G ≡ BUe

G ≡ C→A=T

由于5-BU的诱变作用是在DN

A复制过程中实现的，因 由于5 BU的诱变作用是在DNA复制过程中实现的， 由于 的诱变作用是在DNA复制过程中实现的 处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。 此，处在静止或休眠状态的细胞是不适合的。 细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子， 细菌采用对数期的细菌，霉菌、放线菌采用孢子， 细菌采用对数期的细菌 但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5但要进行前培养，使孢子处于萌动状态，并要加大5 BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。 BU的浓度，处理过程要进行振荡培养。 的浓度

2-氨基嘌呤(2-AP) 氨基嘌呤( ) 氨基嘌呤 比较容易诱发AT→ 这一转换 比较容易诱发 →GC这一转换

A T

2AP T

2AP* C

G C

碱基类似物的诱变处理方法( 为例) (二)碱基类似物的诱变处理方法(以5-BU为例) 为例5-BU是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下： 是白色结晶粉末，能溶于水或乙醇。诱变处理方法如下： 是白色结晶粉末

1.单独处理 单独处理 新鲜斜面的细菌——转接到前培养的液体培养基中 转接到前培养的液体培养基中——培养 新鲜斜面的细菌 转接到前培养的液体培养基中 培养 到对数期——离心除去培养液 离心除去培养液——加入生理盐水或缓冲液 加入生理盐水或缓冲液— 到对数期 离心除去培养液 加入生理盐水或缓冲液 —饥饿培养 饥饿培养8—10小时 小时——加入 加入5-BU到培养液中，使最后的 到培养液中， 饥饿培养 小时 加入 到培养液中 处理浓度为25—40µg/ml,混合均匀 混合均匀——取0.1—0.2ml菌悬液 处理浓度为 混合均匀 取 菌悬液 加入到琼脂平板上涂布培养——在适宜温度下，使之在生长 在适宜温度下， 加入到琼脂平板上涂布培养 在适宜温度下 过程中诱变处理——培养后挑取单菌落，进行筛选。 培养后挑取单菌落，进行筛选。 过程中诱变处理 培养后挑取单菌落

真菌、放线菌孢子，则要提高 的浓度( 真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度(0.1—1mg/ml), 的浓度 ), 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时 一般 一般6—12h)——分离 加到孢子悬液后，进行振荡培养数小时(一般 分离 于平皿——适温培养 适温培养——挑取单菌落，进行筛选。 挑取单菌落， 于平皿 适温培养 挑取单菌落 进行筛选。

2.与辐射线复合处理 与辐射线复合处理 据报道，如果菌体先用 等碱基类似物进行处理， 据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理， 等碱基类似物进行处理 使它们首先渗入到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变 分子中，然后用辐射线照射， 使它们首先渗入到 分子中 效果会

比单独使用辐射线更好。因此， 效果会比单独使用辐射线更好。因此，碱基类似物也是一 种辐射诱变的增敏剂。 种辐射诱变的增敏剂。

二、化学修饰碱基的诱变剂

改变碱基结构的化学修饰剂：脱氨剂、羟化剂 脱氨剂、 脱氨剂 常见的碱基修饰剂

亚硝酸( 羟胺( 甲基磺酸乙酯( 甲基- -硝基(a)亚硝酸(b)羟胺(c)甲基磺酸乙酯(d)N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍16

1.脱氨剂亚硝酸( acid) 亚硝酸(nitrous acid)是典型的脱氨剂 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子 DNA G C A 黄嘌呤X 黄嘌呤X(xanthine ) U 次黄嘌呤H 次黄嘌呤H

亚 硝 酸 的 脱 氨 基 作 用 及 其 诱 发 的 突 变

亚硝酸诱发的突变HNO2 A T H C G C G C HNO2 A U A T

A:T

G┆C

亚硝酸的处理方法 1. 试剂的配制(1)1mol/LpH4.5醋酸缓冲液 ) 醋酸缓冲液 (2)0.1mol/L亚硝酸钠溶液 ) 亚硝酸钠溶液 (3)0.07mol/LpH8.6磷酸氢二钠溶液 ) 磷酸氢二钠溶液

2.处理方法(以处理浓度 处理方法(以处理浓度0.025mol/L为例) 为例) 处理方法 为例 取孢子悬液 取孢子悬液1ml,pH4.5醋酸缓冲液 ， 醋酸缓冲液2ml及0.1mol/L亚硝酸钠溶 醋酸缓冲液 及 亚硝酸钠溶 液1ml,最后处理浓度为 ，最后处理浓度为0.025mol/L。于25—26℃保温 。 ℃保温10— 20min,加入 的磷酸氢二钠溶液20ml,使 ，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氢二钠溶液 、 的磷酸氢二钠溶液 ， pH下降至 左右，以终止反应。稀释分离于平板。 下降至6.8左右 下降至 左右，以终止反应。稀释分离于平板。

如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05mol/L为例：将 如果是处理细菌，亚硝酸最后浓度以 为例： 为例 斜面新鲜菌体移入肉汤培养基，适温培养到对数期， 斜面新鲜菌体移入肉汤培养基，适温培养到对数期，将培养 液进行离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤。pH4.5醋酸缓 液进行离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤。 醋酸缓 冲液和0.1mol/L硝酸钠溶液 浓度加入沉淀的菌体中，使 硝酸钠溶液1:1浓度加入沉淀的菌体中 冲液和 硝酸钠溶液 浓度加入沉淀的菌体中， 之悬浮。 倍的pH8.6的磷 之悬浮。于35—37℃处理 ℃处理5—10min、加入 倍的 、加入5倍的 的磷 酸氢二钠溶液， 下降到6.8。 酸氢二钠溶液，使pH下降到 。取一定量进行后培养 下降到 1.5—2h。然后稀释分离于平板上。 。然后稀释分离于平板上。

注：在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度， 在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度， 否则会影响诱变效果。 否则会影响诱变效果。