TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能(3)

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

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NA,将每个cDNA样品取出一部分,组成各种处理材料的混合cDNA模板),以TaNAC F/R为引物,进行RT PCR反应,扩增程序:94 预变性5min,94 变性30s,62 退火45s,72 延伸1min,共32个循环,之后72 10min。

1 4 构建系统进化树与基序分析

使用DNAMAN软件将测序成功的核苷酸序列翻译为蛋白序列,进化树分析之前,NCBIBLAST搜集TaNAC的近缘序列,包括DREB家族及NAC家族的几个基因,整理得到这些序列开放阅读框(ORF)的FAS TA文件,在MEGA4 0中生成进化树,主要参数设置为:邻近法建树,拔靴法(重复计算次数1000;随机种子64238),成对缺失,泊松修正

[26]

中国烟草学报 2010年12月第16卷第6期

基因和内参基因的CT值;Timex指处理的不同时间点(胁迫处理1h、2h、5h、10h、24h),Time0表示经actin校正后1倍量的目标基因未处理时的表达量。

CT=(CT.Target-CT.Actin)Timex-(CT.Target-CT.Actin)Time0

1 6 转基因烟草抗旱功能验证

将TaNAC基因连接到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,构建过量表达载体,并通过根癌农杆菌C58C1介导的烟草叶盘转化法转化到烟草W38株系中。待PCR检测为阳性的转基因烟草植株生长到一定高度后移栽至花盆,24 ,16h光照培养,5个月左右收获种子,之后进行模拟干旱胁迫处理,经消毒处理的种子播种到含2%PEG的MS培养基中,观察转基因苗和野生型对照的生长情况。

。将TaNAC同几个

NAC家族的序列提交到TheMEMEsuitetool(/meme4_4_0/cgi bin/meme.cgi),主要分析其N端序列,将TaNAC同DREB家族的几个序列同样提交到该网站,主要分析其C端序列。本实验中用于进化树分析和基序分析的蛋白序列GeneBank登录号如下:WheatTaNAC2(AY625683),(HM027572),(DQ394702),

TaNAC6OsNAC4

(HM027573),(AB028183),

TaNAC4TaDREB4BONAC300

2 结果与分析

2 1 TaNAC基因的克隆

本实验以小麦胁迫处理材料的混合cDNA为模板,利用同源克隆的方法分离得到1个NAC转录因子家族的基因,其核苷酸序列及编码的氨基酸序列如图1,TaNACORF长度1445bp,编码485个氨基酸,Scan Prosite(/tools/scanprosite/)输出的NAC保守域在图中用灰色背景标示。2 2 进化树生成与基序分析

TaNAC与NAC及DREB转录因子的系统进化关系如图2,图中显示,TaNAC与DREB进化关系更近,这个结果与NCBIBLAST查询一致,均说明我们所分离的基因的特殊性,该基因与所有的已知序列相似性都很低,它具有NAC转录因子的保守结构域,而从进化关系上看来,又具有DREB家族的特征,进一步的序列基序分析发现,TaNAC与NAC家族的其他转录因子相比,保守域序列的保守性较差,其亚结构域并非典型的A,B,C,D,E5个亚结构域[28],而只包含A,B,D3个亚结构域(图中的motif1,2,3,4,5分别对应亚结构域B,D,A,E,C),且保守性也较差(如图3A)。对TaNAC与部分DREB家族的蛋白序列基序分析表明,TaNAC与DREB家族的某些基因相似性更近,这些序列的C端至少共享4种以上基序(motif1,5,6,10),如图3B所示。

(AAX13283),TaDREB4A(AAX13282);riceSNAC1(AB182278);Leymuschinensisunnamed(ACH73204);AegilopscolumnarisDRF1(ACX94335)。1 5 TaNAC干旱、高盐逆境胁迫下的基因表达

利用步骤1 2中反转录得到的干旱、高盐胁迫处理的cDNA模板,实验研究了TaNAC基因在这两种非生物胁迫条件下的表达情况。选用wheatactin(GeneBank登录号AB181991)作为本实验的内参基因,内参基因扩增引物actin F:5 CGGCTACCACATCCAAGGAA 3 ;actin R:5 GCTGGAATTACCGCGGCT 3 。从目的基因的非保守序列部分设计引物,控制扩增片段长度尽量接近内参基因长度,目的基因扩增引物序列TaNAC F1:5 AGGACCACTTGTTCAAACCG 3 ,TaNAC R1:5 CCAGCATGAAGATTGTCCCT 3 。本实验环节PCR扩增程序:95 预变性15min,95 20s,60 20s,72 20s,共40个循环,72 10min。实时定量RT PCR完成后,采用2 CT算法[27]分析实验结果(公式如下),其中CT.

Target和CT.Actin分别是目标