蛋白质的测定原理

全氮的测定凯氏定氮法： 凯氏定氮法：消化、蒸馏、吸收、滴定 。 杜马斯燃烧法 ：燃烧、还原、净化、检测 。

凯氏定氮法原 理 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂 作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转 作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转 化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨 化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出， 用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量， 硼酸吸收后，再用酸 将结果乘以换算系数6.25,计算出粗蛋白含 将结果乘以换算系数6.25,计算出粗蛋白含 量。

实验反应 :1.试样中的氮在强热条件下CuSO4, K2SO4 , 浓H2SO4 作用下， 作用下， 1.试样中的氮在强热条件下

消化生成( 消化生成(NH4)2SO4

NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO42.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ,收集于 H3BO3 溶液中。 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 溶液中。 在凯氏定氮器中与碱作用

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH4OH NH3+H3BO3=NH4H2BO3再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI HCI标准溶液滴定 HCI消耗的量计算出氮的含 3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含 然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

NH4H2BO3 + HCl =H3BO3 + NH4Cl

各种试剂的作用 1. 消化： 消化：硫酸： 硫酸： 1. 脱水。使有机物炭化，生成C, 脱水。使有机物炭化，生成C 2. 氧化。 H2SO4将C、 H氧化为CO2和H2O蒸汽逸 氧化为CO 出，本身还原为SO ,而pro则分解成氮，则与硫 出，本身还原为SO2,而pro则分解成氮，则与硫 酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中

硫酸钾：提高温度。 硫酸钾：提高温度。 1. 它与硫酸反应生成硫酸氢钾，一般纯硫酸加热沸 点330℃,温度可达400℃,加速了整个反应过程。 330℃,温度可达400℃ 2. 此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类。 理由：随着消化过程硫酸的不断地被分解，水 理由：随着消化过程硫酸的不断地被分解，水 分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加 速了有机的分解。 3. 硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的 硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。

硫酸铜： 硫酸铜： 1.催化剂 加速反应 1.催化剂 硫酸铜，氧化汞或 粉作为催化剂以及加入少量过 硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过 氧化氢作为氧化剂，次氯酸钾防止污染通常使用 氧化氢作为氧化剂，次氯酸钾防止污染通常使用 硫酸铜。 2.碱性反应指示剂 2.碱性反应指示剂 有机物全部消化后，出现硫酸

铜的兰绿色，可以 作为指示剂。

方程式CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=CuSO4+H2O+SO2 C+CuSO4=Cu2SO4+SO2+CO2蓝绿色 褐色

2. 蒸馏： 蒸馏： 样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨， 在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过 量，二是要防止样液中氨气逸出。

3. 吸收与滴定： 吸收与滴定： 蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准 硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后 再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸 或盐酸溶液，从而计算出总氮量。 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收 后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱 酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应， 它有吸收氨的作用。

计算公式： 计算公式：粗蛋白质(%)=(V2-V1)·c×0.0140×6.25/(m×V ’/V) ×100 (%)= 0.0140× 粗蛋白质(%)式中： 式中： V2─ 滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL; 滴定试样时所需标准酸溶液体积， ; V1── 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL; 滴定空白时所需标准酸溶液体积， ; c── 盐酸标准溶液浓度，mol/L; 盐酸标准溶液浓度， ; m── 试样质量，g; 试样质量， ; V── 试样分解液总体积，mL; 试样分解液总体积， ; V‘ ── 试样分解液蒸馏用体积，mL; 试样分解液蒸馏用体积， ; 0.0140 与1.00mL盐酸标准溶液〔c(HCl)=1.000mol/L〕相当的、以 盐酸标准溶液〔 盐酸标准溶液 ( ) 〕相当的、 ── 克表示的氮的质量。 克表示的氮的质量。 6.25─ 氮换算成蛋白质的平均系数。 氮换算成蛋白质的平均系数。

注意事项(1)K氏烧瓶和取样量 (2)分解剂A H2SO4和K2SO4的添加量 1g样品 1g样品 K2SO4: H2SO4=7g:12ml =7g: 这种比例在国内外公认。 还有一种比例： K2SO4:H2SO4=10:20ml =10:

B 催化剂 (3)热源的强度

4.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐 4.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐 向蒸馏瓶中加入浓碱时 色沉淀物。浓碱与硫酸铜反应， 色沉淀物。浓碱与硫酸铜反应，生成 氢氧化铜， 氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化 铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成 铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成 深兰色的络合物 的络合物。 深兰色的络合物。