柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

华中农业大学

博士学位论文

柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

姓名：徐小勇

申请学位级别：博士

专业：果树学

指导教师：刘继红;邓秀新

20060601

柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

摘要

’原生质体融合技术能有效克服柑橘有性杂交不亲和、雌和／或雄性败育以及珠心 胚干扰等问题，实现核ＤＮＡ和胞质ＤＮＡ重组，为柑橘遗传改良提供了一条新的途

径。本研究旨在针对我国一些优良柑橘品种种子多的问题，拟采用“胞质体．原生质体”融合和非对称融合，将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽品种中，以获得新的柑橘无核种质。此外，本研究对本实验室以前通过原生质体融合获得的４个组合的体细胞杂种植株进行了核质遗传分析。主要研究结果如下：

１．开展了柑橘胞质体分离的研究，建立了高效的柑橘胞质体分离体系。首先以柑橘胞质雄性不育材料．温州蜜柑国庆１号（Ｃｉｔｒｕｓｕｎｓｈｉｕ）的胚性悬浮系为试材分离原生质体，再通过不连续的甘露醇．蔗糖梯度和超速离心方法分离胞质体；比较了不同的离心速度、离心时间、离心温度、梯度组分的体积和浓度对胞质体分离的影响，结果表明，转速为３８０００ｒ／ｍｉｎ，温度为２５℃，离心２０ｍｉｎ，１５％蔗糖浓度（悬浮原生质体的下层溶液）是分离胞质体最适宜的条件，可获得纯度为９０％的胞质体；胞质体的平均直径为２３．２ｇｍ；使用ＦＤＡ染色，发现胞质体的活力在７５．８５％之间；、采用低熔点琼脂糖包埋培养，４８ｈ后胞质体破裂死亡。

２．开展了柑橘“胞质体．原生质体”融合，获得了国庆ｌ号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋诺瓦橘柚（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａＸＣｐａｒａｄｉｓｉ）、国庆１号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ，ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋默科特橘橙（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａｘＣ．ｓｉｎｅｎｓ＆）２个组合的再生愈伤组织和胚状体。前一组合得到的愈伤组织在诱导胚状体的２％甘油培养基上未见进一步生长和分化；从后一组合，挑出的４４个单个小愈伤培养在２％甘油培养基上，有３个分化出胚状体。对后一组合再生的三个细胞系进行倍性和核质基因组分析，结果表明，再生的细胞系均为二倍体，核ＤＮＡ来自默科特橘橙，而线粒体ＤＮＡ来源于国庆１号。

３．研究了紫外线（ＵＶ）照射柑橘原生质体作为喂养层培养目标原生质体的效果，发现ＵＶ照射的原生质体作饲养层具有促进愈伤原生质体生长的作用，而对叶肉原生质体的生长无促进作用；研究了ＵＶ对柑橘原生质体ＤＮＡ片段化的影响。结果表明，ＵＶ处理后的原生质体比未处理的原生质体发生较高的ＤＮＡ片段化。

４．开展了ＵＶ处理供体的非对称融合研究，获得了国庆５号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．５）＋默科特橘橙（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａｘＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、国庆１号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋诺瓦橘柚（Ｃｒｅｔｉｃｕｌａｔａ×Ｃｐａｒａｄｉｓｅ）、国庆ｌ号（Ｃｕｎｓｈｉｕ，ＣＶ．ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）＋锦橙（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）共３个组合的再生愈伤组织和芽。其中前２个组合获得了愈伤组织，后一个组合再生了芽，采用ＦＣＭ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ和ＣＡＰＳ对再生的四个芽系进行鉴定，结果表明，再生的芽系为二倍体、三倍体或四倍体的体１Ｖ

细胞杂种，其胞质基因主要来源于锦橙（受体），其中２个芽系的叶绿体ＤＮＡ发生了重组。

５．采用ＦＣＭ，ＳＳＲ，ＳＲＡＰ和ＣＡＰＳ对４个融合组合的再生植株的倍性、核和胞质ＤＮＡ来源进行了鉴定。结果表明，在澳洲指橘＋酸橙属间组合中，分析的６棵植株都是二倍体胞质杂种，其核和胞质ＤＮＡ分别来自酸橙（叶肉亲本）和澳洲指橘（悬浮亲本）；在丹西红橘＋长寿金柑属间组合中，分析的两棵植株都是异源四倍体体细胞杂种，其核来源于双亲，线粒体ＤＮＡ主要来源于丹西红橘（悬浮亲本），也有部分丢失，叶绿体ＤＮＡ则来源于丹西红橘；在沙漠蒂甜橙＋酸橙种间组合中，分析的５棵植株都是异源四倍体体细胞杂种，其核来源于双亲，其胞质ＤＮＡ来源于沙漠蒂甜橙（悬浮亲本）；在丹西红橘＋红江橙种问组合中，分析的两棵植株中一棵为二倍体非对称体细胞杂种，其核ＤＮＡ具有双亲的部分ＤＮＡ，并有重组发生，胞质ＤＮＡ则来源于红江橙（叶肉亲本）；而另一棵则是异源四倍体体细胞杂种，其核ＤＮＡ来源于双亲，并有重组发生，胞质ＤＮＡ则来源于红江橙。

关键词：柑橘，胞质体，“胞质体．原生质体”融合，非对称融合，体细胞杂种，ＳＳＲ，ＦＣＭ，ＣＡＰＳ，ＳＲＡＰ，ＩＩＶＶ

ＳＴＵＤＩＥＳＯＮＰＲＯＴｏＰＬＡＳＴＦＵＳＩｏＮＡＮＤ

ＩＮＨＥＲＩＴＡＮＣＥＯＦＮＵＣＬＥＡＲＡＮＤＣＹＴｏＰＬＡＳＭＩＣＣｏＭＰＯＮＥＮＴＳＯＦＳＯＭＡＴＩＣＨＹＢＲＩＤＳＩＮＣＩＴＲＵＳ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｖｉａｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｉｓａｎｅｗａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｆｏｒｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇｓｏｍｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｂａｒｒｉｅｒｓｉｎｃｉｔｒｕｓｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｂｒｅｅｄｉｎｇ，ｓｕｃｈａｓｓｅｘｕａｌｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ｆｅｍａｌｅａｎｄ／ｏｒｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙａｎｄｐｏｌｙｅｍｂｒｙｏｎｙ，ａｎｄｉｔＣａｎａｌｓｏｒｅａｌｉｚｅｎｏｖｅｌｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆｎｕｃｌｅａｒａｎｄ／ｏｒｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｇｅｎｏｍｅｓ．ＦｏｒｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｔｈｅＣＭＳｔｒａｉｔｏｆＳａｔｓｕｍａｍａｎｄａｒｉｎｔｏｓｅｅｄｙｃｕｌｔｉｖａｒｓａｎｄｏｂｔａｉｎｉｎｇｎｏｖｅｌｓｅｅｄｌｅｓｓｇｅｒｍｐｌａｓｍｓｏｆＣｉ护ｕｓ，“ｃｙｔｏｐｌａｓｔ—ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ’’ｆｕｓｉｏｎａｎｄａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｆｕｓｉｏｎｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｉｎｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｎｕｃｌｅａｒａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｐｌａｎｔｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｉｎｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：

１．ＣｙｔｏｐｌａｓｔｓｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＣｉ驴ｕｓｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｙｓｔｅｍｏｆＣｙｔｏｐｌａｓｔｓｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＣｉｔｒｕｓｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｃｙｔｏｐｌａｓｔｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｃｅｌｌｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆＳａｔｓｕｍａｍａｎｄａｒｉｎ（ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１，ＣＶ．Ｃｉ驴ｕｓｕｎｓｈｉｕ）ｖｉａｕｌｔｒａ－ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎａｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｍａｎｎｉｔｏｌ—ｓｕｃｒｏｓｅｇｒａｄｉｅｎｔ．Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｓｐｅｅｄｓ、ｔｉｍｅ、ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓａｎｄｖｏｌｕｍｅｓｏｆｓｏｌｕｔｉｏｎｓｏｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｔｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｔｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈａｒｕｎｎｉｎｇｔｉｍｅｏｆ２０ｍｉｎａｔ３８，０００ｒ／ｍｉｎｉｎ２５。Ｃａｎｄ１５％ｓｕｃｒｏｓｅ，ａｎｄａｆｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ９０％ｃｙｔｏｐｌａｓｔｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｓｉｚｅｏｆｉｓｏｌａｔｅｄｃｙｔｏｐｌａｓｔｓｗａｓ２３．２／．ｔｍ．Ｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｙｔｏｐｌａｓｔｓｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ７５ｔｏ８５％，ａｓｓｈｏｗｎｂｙＦＤＡｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｗｈｅｎｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｃｙｔｏｐｌａｓｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｓｏｌｉｄｅｍｂｅｄｄｉｎｇｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｙｂｕｒｓｔ４８ｈａｆｔｅｒｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ．

２．Ｃｙｔｏｐｌａｓｔ－ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｕｓｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｅｔｗｅｅｎｃｙｔｏｐｌａｓｔｓｏｆＳａｔｓｕｍａｍａｎｄａｒｉｎａｎｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆｓｅｅｄｙｃｕｌｔｉｖａｒｓ，ｗｈｉｃｈｌｅｄｔｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｃａｌｌｉｏｒｅｍｂｒｙｏｉｄｓｉｎｔｗｏｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．ＩｎｔｈｅｆｕｓｉｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１ｒＣｕｎｓｈｉｕ）ａｎｄＮｏｖａｔａｎｇｅｌｏ（Ｃｒｅｔｉｃｕｌａｔａ×Ｃｐａｒａｄｉｓｅ），ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｃａｌｌｉｄｉｄｎｏｔｄｅｖｅｌｏｐａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｅｍｂｒｙｏｉｄ—ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ（２％ｇｌｙｃｅｒｉｎｍｅｄｉｕｍ）．Ｗｈｉｌｅ，ｉｎｔｈｅｆｕｓｉｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１（Ｃｕｎｓｈｉｕ）ａｎｄＭｕｒｃｏｔｔｔａｎｇｏｒ（ＣｒｅｔｉｃｕｌａｔａｘＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）４４ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｃａｌｌｉｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎ２％ｇｌｙｃｅｒｉｎｍｅｄｉｕｍ，ｏｎｌｙ３ＶＩ

ｅｍｂｒｙｏｉｄｓｃｏｕｌｄｂｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ．Ｆｒｏｍｔｈｅｌａｔｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｒｅｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｅｒｅｃｈｏｓｅｎｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｐｌｏｉｄｙ、ｎｕｃｌｅａｒａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｌｉｎｅｓｇｏｔｔｈｅｉｒｎｕｃｌｅａｒＤＮＡｆｒｏｍｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｐａｒｅｎｔ（Ｍｕｒｃｏｔｔｔａｎｇｏｒ），ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｔｐａｒｅｎｔ（ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１）ｄｏｎａｔｅｄｔｈｅｍｔＤＮＡ．

３．ＴｈｅｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆＵＶ－ｉｒｒａｄｉａｔｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｃａｎｐｒｏｍｏｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，ｂｕｔｈａｄｎｏｐｏｓｉｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｆｏｒｍｅｓｏｐｈｙｌｌｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ；ＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｏｆＣｉｔｒｕｓｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｒｒａｄｉａｔｅｄｂｙＵＶｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｈｉｇｈｅｒＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｔｈｅＵＶｉｒｒａｄｉａｔｅｄｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ．

４．ＴｈｅａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｆｕｓｉｏｎｗｉｔｈＵＶｉｒｒａｄｉａｔｅｄｄｏｎｏｒｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄ，ａｎｄｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｃａｌｌｉａｎｄｓｈｏｏｔｓｗｅｒｅｒｅｃｏｖｅｒｅｄｉｎｔｈｒｅｅｆｕｓｉｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ（ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．５（Ｃｕｎｓｈｉｕ）＋Ｍｕｒｃｏｔｔｔａｎｇｏｒ（Ｃｒｅｔｉｃｕｌａｔａ×Ｃｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１（Ｃｕｎｓｈｉｕ）＋Ｎｏｖａｔａｎｇｅｌｏ（Ｃｒｅｔｉｃｕｌａｔａ×Ｃｐａｒａｄｉｓｅ）、ＧｕｏｑｉｎｇＮｏ．１（Ｃｕｎｓｈｉｕ）＋Ｊｉｎｃｈｅｎｇｏｒａｎｇｅ（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ））．Ｏｎｌｙｓｈｏｏｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｌａｔｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｆｏｕｒｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃｈｏｓｅｎｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｐｌｏｉｄｙ、ｎｕｃｌｅａｒａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｂｙＦＣＭ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰａｎｄＣＡＰＳ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｈｏｏｔｓｗｅｒｅｄｉｐｌｏｉｄ、ｔｒｉｐｌｏｉｄ、ａｎｄｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｓ．Ａｎｄｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｇｅｎｏｍｅｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｓｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｂｙｔｈｅｒｅｃｉｐｉｅｎｔｐａｒｅｎｔ（Ｊｉｎｃｈｅｎｇｏｒａｎｇｅ）．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｐＤＮＡｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎｔｈｅｔｗｏｓｈｏｏｔｓ．

５．ＦＣＭ、ＳＳＲ、ＳＲＡＰａｎｄＣＡＰＳｗｅｒｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｔｈｅｐｌｏｉｄｙｌｅｖｅｌａｎｄｎｕｃｌｅａｒａｎｄｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｓｉｎｆｏｕｒｆｕｓｉｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．ｒｅｓｕｌｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈａｔｉｎＭｉｃｒｏｃｉｔｒｕｓｐａｐｕａｎａＳｗｉｎｇｌｅ＋Ｓｏｕｒｏｒａｎｇｅ（Ｃｉｔｒｕｓ

Ｌ．）ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｉｘａｎａｌｙｚｅｄｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｄｉｐｌｏｉｄｃｙｂｒｉｄｓ，ｗｈｉｃｈ

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｉｔｒｕｓ，ｃｙｔｏｐｌａｓｔ，“ｃｙｔｏｐｌａｓｔ－ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ”ｆｕｓｉｏｎ，ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｆｕｓｉｏｎ，ｓｏｍａｔｉｃｈｙｂｒｉｄｓ，ＳＳＲ，ＦＣＭ，ＣＡＰＳ，ＳＲＡＰ，ＵＶＶＩｌｌ

缩略词表ｌＸ

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书

学位论文

是否保密如需保密，解密时间年月Ｅｔ

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．

研究生签名：≠蠡．小易时问：奠。。‘年６月ｆ吕日

学位论文使用授权书

本人完全了解。华中农业大学关于保存，使用学位论文的规定”，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印．缩印或扫描等复制手段保存．汇编学位论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表．传播学位论文的全部或部分内容．

注：保密学位论文在解密后适用于本授权书．

学位论文作者签名：？刍，一易导师签名：妄（往扣

签名日期：工－６６年‘月１８日签名日期：ａｏｏｇ年占，ｑ０２０甘注：淆将本衷直接装订在学位论文的扉页和日采之问

第一章文献综述

ｌ问题的提出

柑橘是世界第一大水果，全世界的柑橘有１亿ｔ、７４０万ｈｒｎ２；全世界年贸易量为６５亿荚元，足第３大贸易农产品（邓秀新，２００４）。我国是世界上柑橘重要原产地，柑橘资源丰富，栽培历史悠久；柑橘业发展也呈方兴未艾之势，２００４年，我国柑橘种植面积为１６３万ｈｍ２，居世界第一位；产量为１４９６万ｔ，仅次于巴西，居第二位。柑橘业在我国农村产业结构调整中起到了举足轻重的作用，发展柑橘已成为山区农民致富的一种途径。但我国柑橘发展也存在一些问题，主要表现在缺少自己的特色品种。目前，很多在我国广为种植的品种（如脐橙和温州蜜柑系列）主要从国外引进。同时，随着经济的发展和由卖方市场向买方市场的转变，对柑橘果实品质的要求越来越高，只有优质品种才能满足柑橘业市场和消费者的要求。

无核是柑橘鲜食品种的重要性状，培育无核品种目前已成为全世界柑橘育种的重要目标。理论上，获得无核品种主要有以下两个途径：三倍体水平的育种和二倍体水平的育种．前者主要通过胚乳培养、二倍体与四倍体杂交获得三倍体，如我国学者王大元等（１９７８）、陈如林等（１９９１）以及荚国Ｇｍｉｔｔｅｒ等（１９９０）通过胚乳培养都得到了三倍体植株，Ｓｏｏｓｔ和Ｃａｍｅｒｏｎ（１９８０，１９８５）用二倍体无酸柚与四倍体葡萄柚杂交得到‘Ｏｒｏｂｌａｎｅｏ’和‘Ｍｅｌｏｇｏｌｄ’两个三倍体，但上述研究由于受到胚乳再生植株生长势弱、缺少四倍体等不利因素的影响，从而进展较慢（ＧｍｉｔｔｅｒＧｒｏｓｓｅｔｅｔａ１．．１９９０；ｅｔａｌ．，１９９８）；第二种途径则主要通过选种（如芽变选种、实生选种等）获得，这一途径是目前获得无核品种的主要途径。应该看到，虽然通过芽变选种和实生选种已经获得了不少无核品种，但主要局限于脐橙和温州蜜柑两种类型，在其它类型则很少。我国还有很多柑橘品种品质很好，但种子多，如沙田柚是目前不少柑橘产区作为品种结构调整的主选品种，品质优良，在国际市场上已有一定声誉，但其最大不足是种子多，平均每果有种子８０．１００粒，影响其商品特性和市场竞争力。因此，对这样的品种进行改良以期获得无核品种显得尤为重要，一定程度上会增强我国特色柑橘的国际市场竞争力，进一步促进我国柑橘业的发展。

温州蜜柑是柑橘中典型的无核类型，其根本原因是雄性不育，日本学者Ｙａｍａｍｏｔｏ等（１９９７）通过ｌＯ多年的研究发现导致温州蜜柑无核的雄性不育主要与其胞质因子有关，并且认为将温州蜜柑控制雄性不育的胞质转移到多籽品种，也会导致雄性不育，进而获得无核品种。有性杂交是转移胞质因子的常规方法，但与大田作物和其它类果树不同，柑橘有性杂交具有两大弱点：第一，绝大多数柑橘品种具有多胚性特点，即除合子有性胚外，还具有多个珠心无性胚，使得柑橘有性杂交后不易甚至不能获得真正的杂种苗，即使得到了杂种苗，又常常与珠心胚来源的苗

（珠心苗）混杂在一起，很难予以鉴别；第二。部分柑橘品种雄性和／或雌性败育，限制了很多杂交组合的选配，使得有性杂交工作难以开展。此外，有性杂交在转移胞质基因的同时，也实现了杂交双方核基因的重组，如果只希望转移胞质因子，则通常需要经过５．８代甚至８．１０代的回交才能将胞质供体的核代换掉，而这则是一个很费时和费力的工作。温州蜜柑是雄性不育类型，在杂交中只能作为母本，但它又是多胚类型，通过有性杂交转移温州蜜柑雄性不育胞质具有较大的难度，因此寻找更有效的胞质转移方法显得尤为重要。

原生质体融合是获得胞质杂种（指只具有融合亲本一方的核和双方，另一方细胞质的杂种）、一步转移胞质因子的有效方法。自１９７２年Ｃａｒｌｓｏｎ等获得首例烟草体细胞杂种以来，已得到很多作物的体细胞杂种。其中通过“原生质体．原生质体”对称融合方式，再生的植株绝大部分为二核杂种，如在柑橘体细胞杂种中，９８％的杂种为二核杂种（Ｇｒｏｓｓｃｒｃｔａ１．，２０００），其最终结果是造成杂种倍性增加，不利于品种

ａ１．。２００５）。Ｚｅｌｃｅｒ等（１９７８）首次尝试了非对称融

ｍａｌｅ改良。虽然再生了少数胞质杂种但其频率较低，不利于新种质的创造和品种改良（Ｊｏｈｎｓｏｎｃｔａ１．，２００１；Ｇｒｏｓｓｅｔｃｔ合方法。得到烟草种问胞质杂种，实现了控制ＣＭＳ（Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，胞

质雄性不育）的线粒体基因组转移。之后，通过这方法得到了一些胞质杂种（Ｖａｒｄｉｅｔａｌ．。１９８９；Ｂａｓｔｉａｅｔａｌ．，２００１；Ｓｕｎｅｔａｌ．，２００５）。现已证明，非对称融合是一种直接转移胞质基因组（细胞器）从而得到胞质杂种的有效方法。但由于辐射去除胞质供体染色体的随机性很大，在更多情况下得到的杂种为非对称杂种，仍然保留有胞质供体的部分染色体（Ｌｉｕｃｔａｌ．，１９９９；Ｔｉａｎｅｔａｌ．，２００２）。在二十世纪八十年代，兴起的“胞质体．原生质体”融合为直接转移胞质因子、克服杂种倍性增加等问题提供了一条新的途径。迄今为止，已通过“胞质体．原生质体”融合方法获得了烟草＋烟草（Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇｅｔａ１．，１９９１；Ｍａｌｉｇａ

ｅｔｃｔａ１．，１９８２）、萝卜＋油菜（Ｓａｋａｉｅｔａ１．，１９９０）、大白菜＋花椰菜（Ｓｉｇａｒｅｖａ

从而限制了它的应用。ａ１．，１９９７）等组合的胞质杂种，均有效地实现了胞质因子的转移。但由于“胞质体．原生质体”融合要求制备大量有活力的胞质体，操作比较难，

华中农业大学柑橘课题组自１９９０年以来通过对称融合和非对称融合已得到近４０例柑橘种属间体细胞杂种。本研究在已有的基础上，开展“胞质体．原生质体”融合和非对称融合以期将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽柑橘类型，以获得新的柑橘无核种质；同时，对本课题组得到的一些体细胞杂种进行核质遗传分析，为研究柑橘体细胞杂种核质互作和了解体细胞杂种田问表现等方面提供理论基础。２前人研究进展

２．１柑橘原生质体融合研究进展２

上世纪７０年代兴起的生物技术为柑橘品种改良开辟了一条新的途径。原生质体融合技术能克服柑橘有性杂交不亲和、性器官败育和珠心胚干扰等问题，此外还可以实现胞质基因重组，是有性杂交的有效补充．自Ｏｈｇａｗａｒａ等（１９８５）得到首例属间体细胞杂种植株以来，到目前为此，全世界已获得了２５０多例柑橘体细胞杂种（Ｇ－ｔｏｓｓｅｒｅｔａ１．，２００５），这些体细胞杂种的获得为柑橘种质资源库增添了不少新的成员，同时为柑橘育种和遗传改良提供了大量可供选择和利用的宝贵材料。可以说，柑橘原生质体融合是所有作物中最为成功的，也是体细胞杂种获得和保存最多的类型。目前，部分体细胞杂种已表现出有较好利用价值的前景，尽管在柑橘体细胞融合研究方面还有一些不完善的地方，但所得到的体细胞杂种一定会为柑橘业的发展作出贡献。

２．１．１柑橘原生质体融合方法

柑橘原生质体融合早期是采用ＰＥＧ（聚乙二醇）融合法完成的，尤其是美国和法国等研究人员到目前为止仍然采用此法；ＰＥＧ融合法由Ｋａｏ和Ｍｉｃｈａｙｌｕｋ（１９７４）创立，该方法具有融合率相对较高、费用低等优点，但对细胞有毒害作用．１９９２年日本科学家Ｈｉｄａｋａ和Ｏｍｕｒａ将电场诱导融合方法用在柑橘上获得了成功，之后郭文武（１９９８）在我国首次采用电场诱导柑橘原生质体融合，对融合参数进行了优化，得到了融合频率较高（双核异核体率可高达１５％）的参数体系，并获得了多个组合的柑橘体细胞杂种。该方法操作简便、融合率高、对原生质体无毒害作用，并能促进细胞生长和植株再生（Ｐｕｉｔｅｅｔａ１．，１９８６；ＤｅＦｉｌｉｐｐｉｓｅｔａ１．，２０００）；但需要昂贵的实验设备，故在一定程度上限制了它的应用。最近，Ｏｌｉｖａｒｅｓ－Ｆｕｓｔｅｒ等（２００５）结合两者融合方式的优点，发展了一种新的融合方法．电化学融合，该方法能有效促进融合细胞的分裂并高效诱导胚状体发生。

２．１．２柑橘原生质体融合方式

柑橘原生质体融合的方式以对称融合为主，采用的融合模式主要是“叶肉原生质体＋胚性愈伤组织原生质体”融合模式（Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａ１．。２０００），但也有少数实验室采用“胚性愈伤组织原生质体＋胚性愈伤组织原生质体”的融合模式（Ｏｌｌｉｔｒａｕｌｔｅｔａ１．，１９９６）。由于柑橘叶肉原生质体在现有培养条件下不能再生，前一种融合模式实际上是一种半筛选性的融合模式，所以现有的柑橘体细胞杂种主要由这一种融合模式获得。此外，还有５例非对称融合和ｌ例微原生质体融合的报道（Ｖａｒｄｉ

Ｌｉｕｅｔｅｔａ１．，１９８７，１９８９；ａ１．，１９９９，２０００ｂ＇２００２ａ；Ｌｏｕｚａｄａｅｔａ１．，２００２）。

２．１．２．Ｉ柑橘对称融合研究

柑橘是木本植物中融合技术体系最完善的、获得体细胞杂种最多的树种。得到的体细胞杂种植株绝大部分通过对称融合得到，其中包括种间，属阃组合（Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔ

ａＩ．．２０００；Ｆｕｅｔａ１．。２００４；Ｔａｋａｍｉｅｔａ１．，２００４；２００５），甚至还有一些族间组合（ＧｕｏａｎｄＤｅｎ‰１９９８；１９９９）。目前，柑橘细胞融合工作，主要是针对生产和育种中的问题，有目的地选配融合亲本基础上开展的。例如，在墨西哥，墨西哥来橡（ｅａｕｒａｎｔｉｆｏｌｉａ）是一种重要的柑橘砧木品种，但在二十世纪７０年代以来每年由于柑橘脚腐病（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｐａｒａｓｉｔｉｃａＤａｓｔｕｒ．）弓ｌ起３．５％墨西哥来檬种苗死亡。Ｍｅｄｉｎａ－Ｕｒｒｕｔｉａ等（２００４）为了替代来檬砧木，获得新型、多抗、适应性广且矮化的砧木，开展了Ａｍｂｌｙｃａｒｐａ宽皮橘与枳或枳杂种属间对称融合，获得了大量体细胞杂种植株，目前正在进行作为商业品种应用的田问评价。

２…１２２柑橘非对称融合研究

柑橘对称融合获得的体细胞杂种中９０％以上为异源四倍体。这些异源四倍体综合了双亲核遗传物质，在导入有益性状的同时，又带进了许多不期望的性状；此外，由于两亲本的核和胞质基因组的基因问相互影响也会引起基因型的不稳定，从而影响到体细胞杂种的表现。现有研究表明，异源四倍体体细胞杂种果皮粗糙、厚，难以成为商业接穗品种，只能作为砧木应用或作为倍性杂交创造三倍体无籽柑橘的亲本（Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａ１．，２０００）。

非对称融合是转移部分遗传物质的有效手段，可获得非对称杂种或胞质杂种，可能会解决对称融合倍性增加，优劣性状均进入杂种以及再生体细胞杂种不育或育性低等问题，同时能实现转移控制ＣＭＳ的胞质基因组而获得胞质杂种的目标。Ｖａｒｄｉ等（１９８７，１９８９）将ｙ射线辐射供体的原生质体与碘乙酸处理受体的原生质体进行融合，采用饲养层培养方式培养融合物，获得了５例柑橘二倍体胞质杂种。其中，对澳州指橘（供体）与酸橙（受体）、粗柠檬（受体）组合的再生植株进行了胞质ＤＮＡ分析，发现再生植株除具有双亲线粒体外，还出现了新的ＤＮＡ带型，表明线粒体基因组有重组发生。再生胚的叶绿体为双亲之和或双亲之一，但再生植株的叶绿体与亲本一方相同，说明在再生过程中融合体发生了双亲之一的叶绿体排除，而且排除的速度较快。但朱见这些胞质杂种植株的农艺性状表现的进一步报道。

刘继红等（１９９９；２０００ｂ；２００２）将ｘ．射线照射愈伤组织或叶肉来源的原生质体，与碘乙酸处理的愈伤组织来源的原生质体进行了融合，获得了澳洲指橘与纽荷尔、枳橙与‘Ｐａｇｅ’橘柚属间混倍体愈伤组织和畸形芽以及伏令夏甜橙与‘Ｍｕｒｃｏｔｔ’橘橙、丹西红橘与Ｐａｇｅ橘柚两个组合的种问再生植株。细胞学研究表明，在获得的混倍体体细胞杂种中，主要是二倍体和非整倍体细胞，四倍体细胞只占极小部分。对再生材料进行ＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ，随机扩增多态性ＤＮＡ）分析，表明它们都是体细胞杂种。由此可见，通过１＃对称融合转移部分遗传物质在理论上足可行的。４

２．１．２，３柑橘亚原生质体融合研究

亚原生质体融合在植物上应用的较少，主要是因为亚原生质体（胞质体和微原生质体）的制备比较繁琐，涉及到超速离心或化学药剂的处理。所以，到目前为此，植物中通过亚原生质体融合再生植株的报道仅１０余例，其中柑橘只有ｌ例。Ｌｏｕｚａｄａ等（２００２）通过纺锤体毒素甲基氨草膦（Ａｍｉｐｒｏｐｈｏｓ．ｍｅｔｈｙｌ，ＡＰＭ）处理柑橘悬浮细胞后，分离原生质体，再经超速离心分离到７５．２％只含ｌ条染色体的微原生质体．随之与原生质体融合得到了具有一方亲本全部染色体，同时具有另一方亲本少数几条染色体的再生胚状体或细胞系。由于微原生质体只具有少数染色体，为转移少数遗传物质进行柑橘品种改良提供了一条新的途径。

２．１．３柑橘体细胞杂种在育种上的应用

目前，获得的体细胞杂种植株大部分已经开花结果，有的组合已经进行了农艺性状评价。通过对体细胞杂种的形态性状、开花结果习性、果实待征以及植株抗性（抗脚腐病、抗寒等）等几个方面农艺性状的了解，得到许多有价值的反馈信息，由此发展了不少的细胞融合应用新方向（Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａｌ．，２００５）。

原生质体融合技术在在柑橘品种改良中的应用主要表现在以下三方面：第一，创造新的砧木，柑橘近缘属富含抗性资源，采用原生质体融合技术获得柑橘与其近缘属的体细胞杂种，以获得具有较广抗性的新型砧木。如酸橙，它具有适应性广、耐柑橘疫病、对树体有丰产、优质等优点，曾经是最重要的的砧木品种之一，但由于它不抗柑橘速衰病（ＣｉｔｒｕｓＴｒｉｓｔｅｚａＶＬｒｕｓ，ＣＴＶ），从而限制了它的应用，在大部分地区已经不再使用。Ｇｒｏｓｓｅｒ等（２０００）根据有关分子标记结果——酸橙是柚和橘的杂种（Ｎｉｃｏｌｏｓｉｅｔａ１．，２０００），开展了柚与橘的融合，以便获得能够替代酸橙的新型优良砧木，他们已经得到了ｌＯ多个此类组合的体细胞杂种，有几个组合在茁期表现出很好的生长势（ＧｒｏｓｓｅｒａｎｄＣｈａｎｄｌｅｒ，２００３），这些有希望的体细胞杂种将进行抗ＣＴＶ试验，并进入田问评价。第二，作为倍性杂交的亲本，与单胚二倍体品种杂交，获得三倍体，以选出结果良好且果实无籽新品种。异源四倍体的遗传基础比同源四倍体广，与二倍体杂交后，后代出现的变异更为复杂，从中选出优良的三倍体的机会可能更多。迄今，通过体细胞杂种与二倍体杂交已得到大量三倍体植株（ＪｉａａｎｄＧｍｉｔｔｅｒ，１９９３；邓秀新等，１９９６；伊华林等，１９９７）。第三，直接作为接穗品种予以利用。荚国佛罗里达大学的Ｇｒｏｓｓｅｒ研究小组发现，少数的异源四倍体体细胞杂种具有直接选育为接穗品种的可能，如‘Ｓｕｃｃａｒｉ’甜橙和‘Ｐａｇｅ’橘柚四倍体体细胞杂种早熟、果实表现无核、形状与‘Ｓｕｃｃａｒｉ’甜橙相似、含汁量高、风味好等特点；‘Ｖａｌｅｎｃｉａ’橘柚和‘Ｍｕｒｃｏｔｔ’橘橙体细胞杂种果实少籽（３个果实平均ｌ粒种子）、风味好、易剥皮、中晚熟，这些体细胞杂种都有望成为新的品种（Ｃｒｏｓｓｅｒｅｔａｌ．，２０００）。

２．２柑橘体细胞杂种核质遗传研究进展

二卜一世纪以前，绝大多数柑橘体细胞杂种再生的报道，由于研究手段限制或花费较高仅根据同工酶或ＲＡＰＤ分析确定其杂种性，而没有分析其核和胞质ＤＮＡ来源。随着新的分子标记的增多，如ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，扩增片段长度多态性）、ＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，简单重复序列）和ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，切割扩增片断多态性）等，柑橘体细胞杂种核质遗传研究也趋于简单。这些研究有利于从遗传本质上认识柑橘体细胞杂种杂交过程中的遗传规律，可以研究柑橘体细胞杂种核质互作，了解柑橘核质组成对体细胞杂种田间表现的影响，为选配融合亲本提供理论指导，为柑橘体细胞杂种应用于育种实践奠定基础（刘继红等，２００４）。虽然获得了２５０余例柑橘体细胞杂种，但对核质遗传组成研究较为清楚的组合并不多，表ｌ为迄今为止已进行核质分析的体细胞杂种的核质遗传组成。

２．２．１柑橘体细胞杂种核遗传

早期柑橘体细胞杂种的倍性分析通过染色体压片完成（Ｇｌｏｓｓｅｒ

近流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）常被采用（Ｍｅｄｉｎａ－Ｕｒｒｕｔｉａｅｔ

ｅｔｅｔａ１．，１９９０），最ａ１．，２００４；Ｔａｋａｍｉａ１．。２００５）。该方法对比于前者，速度快、分析结果可靠，但其不足是对植株中少数非整倍性细胞的检测存在难度，且仪器比较昂贵。柑橘体细胞杂种的倍性比较复杂，绝大多数是异源四倍体，其次是二倍体叶肉亲本型杂种，它们在近４０个融合组合中都有获得（邓秀新等，２０００；Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａ１．，２０００），也有一些三倍体杂种再生报道（Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａ１．。１９９２；Ｆｕｅｔａ１．，２００３）。此外，还获得了极少数的五倍体、六倍体以及非整体杂种（Ｍｉｒａｎｄａｅｔａ１．，１９９７；ＧｕｏａｎｄＤｅｎｇ，１９９９；刘继红，１９９９）。可见，柑橘原生质体融合得到的体细胞杂种，在倍性上具有多型性，而其核组成相对比较有规律。四倍体的核组成表现为双亲之和（即表１．Ｉ中的Ｅ＋Ｌ）（Ｏｈｇａｗａｒａ

Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａ１．，１９９６；Ｌｉｕｅｔａｌ．，１９９４；ａｎｄＤａｎｇ，２００１；Ｌｉｕｅｔａ１．，２００４；Ｔａｋａｍｉｅｔａ１．，２００５；Ｘｕｅｔａ１．，２００５），表明双亲的核遗传物质完全综合到杂种中。此外，在枸头橙和枳组合中，对得到的属间四倍体体细胞杂种采用ＧＩＳＨ（Ｇｅｎｏｍｉｃ／ｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，基因组原位杂交）技术分析，发现两亲本问的２对染色体发生了易位，说明体细胞杂交后双亲基因组有遗传重组行为（Ｆｕｅｔａ１．。２００４；陈春丽，２００５）。对于二倍体体细胞杂种而占，其核来自叶肉亲本（ＹａｍａｍｏｔｏａｎｄＫｏｂａｙａｓｈｉ，１９９５；Ｇｒｏｓｓｅｒｅｔａ１．，１９９６；Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉｅｔａｌ．，１９９６；Ｌｉｕｅｔａ１．，２００２ｂ；Ｔａｋａｍｉｅｔａｌ．。２００５）或受体亲本（Ｖａｒｄｉｅｔａｌ．，１９８７；１９８９）（即表１．１中的Ｌ或Ｅ２）。这些二倍体体细胞杂种在形态上与叶肉或受体亲本完全一样，表明其核遗传组成结果与形态学一致。６

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