细胞中活性氧的荧光探针检测法研究进展

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现代预防医学2010年第37卷第22期ModernPreventiveMedicine，2010，Vol.37，NO.22

文章编号：1003-8507（2010）22-4316-02中图分类号：R122.1文献标识码：A

【实验技术及其应用】

细胞中活性氧的荧光探针检测法研究进展

张鑫

综述，王旗

审校

摘要：荧光探针法是一种灵敏的、可提供细胞内靶分子时空信息的活性氧（ROS）检测法。目前常用的荧光探针有

·-）、DCFH和DHR（检测H2O2）等。ROS的检测结果易受以下因素影响：基于氧化还原反应的荧光探针选HE（检测O2

择性差，且反应需要催化剂（过氧化物酶、细胞色素C）；细胞内pH值、抗氧化剂影响检测结果；荧光探针在光照条件下可发生自氧化。近期研究主要集中在如何改进荧光探针的上述局限性。本文对荧光探针法检测细胞内ROS的研究进展进行简要介绍。

关键词：活性氧；荧光探针；DCFH

PROGRESSINMEASUREMENTOFREACTIVEOXYGENSPECIESINCELLSbyUSINGFLU-ORESCENTPROBESZHANGXin，WANGQi.（DepartmentofToxicology，SchoolofPublicHealth，

PekingUniversity，Beijing100191，China）

Abstract：FluorescentprobesaresensitivetoolsinthemeasurementofReactiveOxygenSpeciesincells，anditcanpro-videtemporalandspatialinformationontargetbiomoleculesincellularsystem.Currently，themostfrequentlyusedprobesin-·-），DCFHandDHR（forH2O2）.However，thefollowingaspectstendtomakethedetectionresultsmorecludesHE（forO2

complex：fluorescentprobesbasedonredoxreactionlackselectivityandrequireacatalyst（PeroxidaseorCytochromeC）forreaction；IntracellularPHandantioxidantscanpotentiallyinfluencethedetectionprocess；also，probeauto-oxidationCouldoccurunderphoto-irritation.SomeimprovementsindetectionofROShavebeenachievedinrecentyears.ThispaperfocusedontheprogressintheROSdetectionusingfluorescentprobes.

Keywords：ReactiveOxidativeSpecies；Fluorescenceprobe；DCFH

活性氧（ReactiveOxidativeSpecies，ROS）是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物，主要由氧化呼吸链中的酶复合体Ⅰ和Ⅲ漏出的

·-电子产生，包括超氧阴离子（O2），羟自由基（HO·），过氧

荧光探针是一类无色、无荧光且稳定存在的染料分子，在与ROS发生反应后，探针的化学结构发生变化，生成具有强荧光的产物，因此通过检测反应产物的荧光强度可在一定程度上反映ROS水平［5］。目前应用最广泛的荧光探针主要有

化氢（H2O2），单线态氧（1O2），次氯酸（HOCl）等。ROS在生物体内参与信号转导、调控基因表达、参与免疫反应，但过量的ROS亦可对生物膜以及蛋白质、脂类、核酸等生物大分子造成氧化损伤。对ROS含量变化的研究有助于揭示各种生命活动的内在分子机制［1，2］。但是由于ROS性质活泼，在体内代谢迅速，而生物体内多种抗氧化物的存在都给ROS的测定带来一定难度。因此，寻找灵敏有效的ROS检测方法已成为研究其生物学作用的关键。细胞中ROS的检测方法主要分为四大类：化学发光法、电子自旋共振法、荧光探针法和分光光度法［3］。其中，荧光探针法凭借高分辨率、高灵敏度、可提供细胞内靶分子时空信息的优点在活性氧的研究中得到广泛应用［4］。本文对该方法的影响因素及检测方法研究进展情况进行简要介绍。

Dichlorofluorescindiacetate（DCFH-DA），双氢罗丹明

（Dihydrorhodamine），Hydroethidine（HE）等。

1.11.1.1

·-用于超氧阴离子（O2）检测的荧光探针

Hydroethidine（dihydroethidium，HE）HE可在细胞内

·-被O2氧化而生成荧光产物Ethidium（E+）（激发波长λEx=520

nm，发射波长λEm=610nm），Ethidium可聚积在细胞内与

·-DNA结合，从而增加荧光强度［6，7］。但有研究发现，HE与O2

反应还可生成另一荧光产物2-hydroxyethidium，其发射波长在

·-的检测［8，9］。另外，在非特异性的567nm，也可用于细胞内O2

过氧化物酶催化作用下HE可与H2O2发生氧化反应，生成一类不同于E+的荧光产物，其发生波长与Ethidium接近，从而对荧光信号产生很大干扰。

1.1.2

1

原理与应用

其他荧光探针1，3-Diphenylisobenzofuran（DPBF）和

2-（2-Pyridil）-benzothiazoline也可用于超氧阴离子的检测，其

·-中DPBF可以检测脂质体中的O2，但检测原理与HE相反，·-·-是通过与O2反应后荧光强度的降低程度反映O2的含量［10，11］。

作者简介：张鑫（1985-），女，预防医学2003级长学制学生，研究

方向：中药毒理学

通讯作者：王旗，E-mail：wangqi@http://

作者单位：北京大学公共卫生学院毒理学系，北京，100191

1.21.2.1

用于过氧化氢（H2O2）检测的荧光探针

Dichlorofluorescindiacetate（DCFH-DA）DCFH-DA

是一种无荧光的脂溶性物质，可以自由穿越细胞膜，在细胞内

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被酯酶水解为水溶性的DCFH，该物质在与ROS发生氧化反应后生成具有强荧光的DCF（λEx=488nm，λEm=525nm）用于检测细胞内的H2O2水平，细胞内的过氧化物酶，细胞色素C或Fe（Ⅱ）

（Fenton反应）可催化该反应的进行。因此早期

应用DCFH检测H2O2的研究需要加入外源的辣根过氧化物酶以催化氧化反应的发生，但后期的研究大多忽略了这一点。另据报道，过高浓度的DCFH可产生细胞毒性，影响测定结果［12~14］。

1.2.2双氢罗丹明（Dihydrorhodamine123，DHR）与DCFH类似，双氢罗丹明与ROS反应后生成具有荧光的Rhodamine

123（λEx=505nm，λEm=529nm）。Rhodamine123为带正电

的脂溶性分子，可在线粒体膜电位的作用下聚积于线粒体内而不漏出细胞。另外高浓度DHR可以检测线粒体内单线态氧的生成［4，14，15］。

2活性氧检测的影响因素2.1

荧光探针的选择性

目前用于检测ROS的荧光探针大多是还原性染料，通过

与ROS发生氧化还原反应而产生荧光，但细胞中的ROS（如

超氧阴离子O·2-，羟自由基HO·，H2O2等）大都具有强氧化

性，因此决定了还原型染料的选择性有限。据文献报道，除H2O2外，DCFH也可以被HO·，NO2

·，CO3·-

，单线态氧等氧化而生成DCF，因此DCF的荧光强度应代表细胞整体的氧化应激状态。同样的，DHR也可与多种ROS（OH·，ONOO-等）

反应，但与O·2-、H2O2的反应性较差［12~15］。

2.2细胞色素C对ROS检测的影响

细胞色素C可作为催化剂，催化HE或DCFH与细胞内

ROS的反应。有文献报道，在ROS水平无变化的情况下，凋

亡细胞释放的细胞色素C可使检测到的荧光强度升高，因此在凋亡细胞中研究ROS应慎重解读检测结果［3，4，5，16］。

2.3细胞内环境（pH值、抗氧化剂）对检测结果的影响细胞复杂多变的内环境也可影响ROS的检测过程。例如

在不同的生理状态下，胞浆的pH值与酯酶活性变化可影响探针的装载效率。而抗氧化剂也可通过以下4个方面影响ROS的检测过程：①抗氧化剂与荧光探针竞争与ROS的反应；②硫自由基等由抗氧化剂生成的自由基可与探针反应；③抗氧化剂与探针生成的中间产物反应；④抗氧化剂直接还原探针形成的自由基。在ROS检测过程中，只有细胞内装载的探针（DCFH或DHR）达到毫摩尔级才能有效的竞争抗氧化剂与

ROS的反应，否则抗氧化剂水平的变化将很大程度的影响检测

结果［5］。

2.4自身氧化（光敏性）

已有研究发现，DCFH在250~600nm的光照射下可以发

生自身氧化生成带荧光的DCF

·，即使在没有ROS生成的情况下，光照射产生的DCF

·也可增加细胞内的荧光强度，因此在分析结果时应该充分考虑到光照因素的影响，尽量避光操作。但在用流式细胞仪（FCM）检测DCF·的荧光时，由于在激发光照射的短时间内记录细胞的荧光强度，因此FCM法受到自氧化的影响相对较小。另据报道，可以通过调低DCFH的浓度，或向细胞提供维生素C来降低荧光探针的自氧化率［4，5，17］。

3检测方法研究进展3.1

新型荧光探针的开发

3.1.1bis（2，4-dinitrobenzenesulfonyl）Maeda等［18］报道了不

依赖氧化还原反应的探针bis（2，4-dinitrobenzenesulfonyl），

在PMA（phorbolmyristateacetate）诱导的中性粒细胞中，O·2

-使探针脱保护基，形成荧光基团和两分子2，4-dinitrobenzene-

sulfonicacid，发出荧光，从而一定程度上克服了还原型探针选

择性差的缺点。

3.1.2HPF与APFHPF{2-［6-（4’-hydroxy）phenoxy-3H-xan-

then-3-on-9-yl］benzoicacid}与APF{2-［6-（4’-amino）phe-noxy-3H-xanthen-3-on-9-yl］benzoicacid}是两种新开发的荧

光探针，检测·OH及ONOO-的特异性明显优于DCFH，而不与

H2O2，O·2

-及ROO·反应。在PMA诱导的中性粒细胞中，APF可以检测到荧光信号而HPF无信号，由此推断APF还可特异性检测细胞内的HOCl。另外，APF与HPF对光照不敏感，其自氧化率明显低于DCFH。以上特点使APF与HPF有望在活性氧检测中得到更广泛的应用［19，20］。

3.1.3TDFTTDFT是一类新的·OH检测探针，在一段DNA链

的5’末端与3’末端分别带有6-carboxyfluorescein（6-FAM）（λEx=496nm，λEm=518nm）及5-carboxytetramethylrho-

damine（5-TAMRA）（λEx=558nm，λEm=576nm），其工作

原理是在496nm激发光作用下，探针通过两个荧光素间的荧光共振能量转移（FRET）使TAMRA发出荧光，然后当TDFT与·OH反应时，分子内部的磷酸键被打开，释放FAM的荧光。随着细胞内·OH水平的升高，两个波长的荧光强度比值（λ518／

λ576）增大。根据观察，TDFT对·OH检测有较好的选择性，细

胞内的O·2-，H2O2，ONOO-等均不会与探针发生反应［19］。

3.2新检测技术的引入

Jacek等［21］报道用HE检测牛主动脉内皮细胞（BAEC）内ROS含量的研究，采用了高效液相色谱仪（HPLC）-化学发光

（CL）与电化学检测器（EC）联用的方法检测细胞内产生的超

氧阴离子O·2-。在O·2-存在时，HE可被氧化为2-hydroxyethid-ium或2-hydroxymito-ethidium。而无O·2-时，细胞内的·OH等

氧化剂可以将HE氧化为多种二聚体（HE-HE，HE-E+，E+-E+），而后者无疑会对O·2

-检测的特异性造成干扰，因此通过HPLC-CL与EC联用可以准确测定2-hydroxyethidium，2-hy-droxymito-ethidium及二聚体（HE-HE，HE-E+，E+-E+）的含

量，从而提高HE检测O·2-的选择性。

4小结

荧光探针法是目前应用最广泛的细胞中ROS检测方法，

针对不同的ROS有相应的探针，如HE主要用于检测O2·-，

DCFH与DHR主要用于检测H2O2，但已有大量的研究指出荧

光探针在应用中存在的问题：选择性差，检测过程受到细胞内

pH、抗氧化剂及细胞色素C的影响，易发生自氧化提高背景

荧光强度等。针对这些问题，目前的研究主要集中在两方面：一是深入研究探针与ROS反应的机制，以期开发出兼具敏感性与特异性的新探针。另一方面通过将荧光探针法与其他的分子生物学方法结合，优化荧光探针的检测效率。ROS存在时间短，变化快的特点决定了其检测的难度，但只要选择适当的荧光探针并综合考虑各类影响因素，合理的分析数据，还是可以得到真实可靠的检测结果。

参考文献：

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（收稿日期：2009-12-15）

tionspectrofluorimetrywithafluorescentprobeof2-（2-pyridil）-benzothiazolineforsuperoxideanionradicals［J］.Anal.Biochem，

（上接第4315页）

制片有3种方法：第1种方法是不脱钙直接制片；第2种方法是骨髓组织常规脱钙后制片；第3种方法是采用塑料包埋的方法进行制片［2］。不脱钙的骨髓组织小而硬，切片难，组织破碎，不完整，刀痕多，组织染色偏蓝，制作的切片质量差；用

织标本表面有过度的软化，小心地切去蜡块表面后仍可选取组织硬度和形态较好的组织切面切片，不影响以后的染色。如脱钙不足，可重复脱钙步骤。

比较广泛，脱钙液便于配制，价格便宜。

对骨髓石蜡组织块进行脱钙经我们长期使用证明，它是一种操作简单、制片过程短、可靠实用的组织脱钙方法，弥补了以前制片方法的不足，较为适合普及推广。参考文献：

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［J］.诊断病理学杂志，2005，12（5）：392.

［2］胥维勇，杨群.脱钙方法与脱钙的选择及应用［J］.中国组织化

学与细胞化学杂志，2002，11（3）：263.

（收稿日期：2010-01-06）

（3）

（4）单酸脱钙技术临床运用

5％硝酸液对骨髓组织脱钙，时间难以掌握，脱钙时间过长，

骨髓组织破坏，细胞结构模糊不清；脱钙时间过短，脱钙不充分，骨髓组织较硬，以致切片不完整，易碎，且在染色过程中容易掉片；尽管塑料包埋法是骨髓组织病理制片的较好方法，但其制片过程长，且此操作过程复杂，所用材料价格昂贵。而我科用5％硝酸液对骨髓石蜡组织块进行脱钙代替传统的对骨髓组织直接脱钙方法，有以下优点：重致组织被溶解的现象。

（1）不会因骨髓组织小

且硬而出现脱钙过度，造成组织结构模糊不清现象；甚至更严

（2）如脱钙处理过长则仅是石蜡组