第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建

目的基因的克隆与基因文库的构建

第五章 目的基因的克隆与基因文库的构建一 二 三 四 鸟枪法 cDNA法 PCR法 化学合成法

五

基因文库的构建

目的基因的克隆与基因文库的构建

或确定其表达调控机制和生物学功能

分离克隆目的基因 (前提)

或建立高效表达系统，构建具有经济 价值的基因工程菌(细胞)

或将目的基因在体外进行必要的结构 功能修饰，然后输回细胞内改良生物 体的遗传性状，包括人体基因治疗

目的基因的克隆与基因文库的构建

基因的克隆战略 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基

因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆； 另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合

成目的基因，然后将之克隆表达。

目的基因的克隆与基因文库的构建

一 二 三 四

鸟枪法 cDNA法 PCR法 化学合成法

五

基因文库的构建

目的基因的克隆与基因文库的构建

鸟枪法克隆目的基因的基本策略随机克隆供体细胞的全 基因组DNA片段，然后通过 快速有效的筛选程序从众多 克隆中分离出含有目的基因 的目的重组子，进而获得目 的基因。鸟枪法适用于原核 细菌目的基因的克隆分离。

目的基因的克隆与基因文库的构建

鸟枪法克隆目的基因的基本策略1.染色体DNA的片段化超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端 全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的 基因断开，大小不可控 部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整

2.与载体连接 3.转化受体细胞 4.筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法(筛选模型的建立)

目的基因的克隆与基因文库的构建

鸟枪法克隆目的基因的局限性

工作量较大，需要了解目的基因的背景知识

不能获得最小长度的目的基因

不能除去真核生物目的基因的内含子结构

目的基因的克隆与基因文库的构建

鸟枪法操作的改进1. 使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。 如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA, 然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高

重组子中目的重组子的出现频率

目的基因的克隆与基因文库的构建

鸟枪法操作的改进2. 在连接前将DNA片段进行分级分离例如，已知某目的基因位于1.8 kb的 SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，

琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块， 从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体 进行拼接2.0 kb 1.8 kb

1.6 kb

目的基因的克隆与基因文库的构建

一 二 三 四

鸟枪法 cDNA法 PCR法 化学合成法

五

基因文库的构建

目的基因的克隆与基因文库的构建

cDNA法克隆目的基因的基本策略cDNA第一链的合成mRNAG 5‘ppp’5 G

AAAAAAAAAAAAAAOH 3’

引物G 5‘ppp’5 G

退火AAAAAAAAAAAAAAOH 3’

逆转录酶G 5‘ppp’5 G

dNTPs

TTTTTTTTTTTTTTp 5’

AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’

cDNA第一链

目的基因的克隆与基因文库的构建

cDNA第二链的

合成 自身引导法：获得的双链cDNA 5’端会有几对碱基缺失G 5‘ppp’5 G

AAAAAAAAAAAAAAOH 3’TTTTTTTTTTTTTTp 5’ NaOH 煮沸

TTTTTTTTTTTTTTp 5’OH

3’

Klenow

dNTPs TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’

S1 TTTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAAAA

目的基因的克隆与基因文库的构建

cDNA第二链的合成 置换合成法：获得的双链cDNA 5’端也会有几对碱基缺 失 5‘ppp’5 G GRNaseH AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ DNApol dNTPs AAAATTTOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ S1 5’ 3’ TTTTTTTTTTTTTTOH 3’ AAAAAAAAAAAAAAp 5’ T4-DNA ligase TTTTTTTTTTTTTT 3’ AAAAAAAAAAAAAA 5’

5’

目的基因的克隆与基因文库的构建

cDNA第二链的合成 引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列G 5‘ppp’5 G

AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’

3‘ HOG 5‘ppp’5 G

3‘ HOCCCCCCC 3‘ HOCCCCCCC

退火3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG TTTTTp 5’ Klenow dNTPs

3‘ HOCCCCCCC 5‘ pGGGGGGG

TTTTTp 5’ AAAAAOH 3’

目的基因的克隆与基因文库的构建

cDNA法分离目的基因的基本程序完备分离程序提取细胞总mRNA,合成总cDNA,将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法 筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如 人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等

目的基因的克隆与基因文库的构建

cDNA法分离目的基因的基本程序特异分离程序提取细胞总mRNA,琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA

,由此合成双链cDNA,然后进行克隆特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如 血红蛋白基因等