细胞培养及无菌操作(12)

你还在为没有做过细胞培养实验而烦恼吗？你还在为做细胞实验而痛苦吗？看了这个《细胞培养的有关名词及其概念》相信一定会释疑我的烦恼

5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：

（细胞悬液的细胞数）/ml＝ （ 四个大格子细胞数/4) ×2×104

说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数；公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释；公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3

四.细胞计数要点：

1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；

2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性；

3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；

4.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

五.初学者易犯的错误：

1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。

2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

六.本实验特殊试剂的配制：

4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4℃保存。

工作液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。

八 细胞的冻存

一.冷冻培养基：

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。（冷冻保存使用之DMSO等级，必须为Tissue culture grade之DMSO(如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4℃， 避免反复冷冻解冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO之Nylon 材质滤膜。）

二. 冷冻保存：

（一）冷冻保存方法一：

1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。

3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。