一株蛋白酶产生菌的分离鉴定(2)

５２生物技术

２．２形态特征及生理生化性质分析

２００９年１９（２）

色、粉末状半纤维素。

１．２方法

对产蛋白酶的细菌进行形态特征和生理生化检测，结果表明，该细菌Ｇ一、球状。同时实验结果也表明．该细菌对ｐＨ的耐受范围是ｐＨ６．２—７．８，该菌株需盐但不耐盐（２％），最适ｐＨ６．８条件下的耐受温度是５５℃，该细菌不产木聚糖酶、苯丙氨酸脱氨酶和脂酶。

裹１生理生化实验结果

Ｔａｂｌｅ１

Ｒｅｓｕｌｔ

，

１．２．１取样

取样时，应取距水面１０～１５ｅｒａ的深层水样，先将灭菌带塞子的空瓶，瓶口向下浸入水样，然后反转过来，除去塞子，水即流入瓶中盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，立即进行实验。

１．２．２培养基的筛选

无菌操作取吐曼河水样，将水样连续ｌＯ倍梯度稀释后．准确吸取０．２ｍ１分别涂布于牛肉膏蛋白胨、脂酶、苯丙氨酸脱氨酶、蛋白酶和木聚糖酶培养基的平板上，在恒温培养箱中３７℃先正置培养１ｈ后倒置培养２４ｈ，高氏一号和马丁氏培养基在恒温培养箱中２８℃倒置培养２４ｈ，在产酶培养基长产生透明圈者为阳性反应。

１．２．３分离纯化

采用１．２．２选出的培养基，按以上取样、接种及培养方法对在蛋白酶培养基上产生透明圈的细菌进行鉴定。１．２．４１６ＳｒＲＮＡ序列分析

扩增１６ＳｒＲＮＡ基因和序列测定委托大连Ｔａｋａｒａ公司完

ｏｆｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ

ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ

特征

Ｃ，ｎｍｌ１－ｅａ２ｔｉｏｌｌ

ｐＨｐＨ

分离菌株

一

６．０８．０

＋

一一＋

№ａ（Ｏ％）Ｎａａ（２％）ＮａＣＩ（４％）温度５５℃温度６０℃产酸葡萄糖

果糖乳糖甘露醇麦芽糖

糖发酵实验蛋白酶实验脂酶实验木聚糖酶实验苯Ｉ王ｉ氨酸脱氨酶实验

＋

一＋

、，

成，之后登陆ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｈｉｍ．ｎｉｈ．纠网站，进行序列比

对。

Ｔａｋａｒａ公司在作者提供的培养基中挑取细菌于１０ｔａ灭菌水中变性后离心取上清作为模板。反应条件为：９９℃，１０ｍｉｎ；ＰＣＲ扩增时使用ＴａＫａＲａ１６ＳｒＤＮＡＢａｃｔｅｒｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＰＣＲＫｉｔ（ＣｏｄｅＮｏ．Ｄ３１０），进行ＰＥＲ扩增目的片段。反应体系（．Ｓ０ｔａ）：变性反应液ｌ脚；ＰＣＲＰｒｅｍｉｘ２５一；Ｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｎ．１ｅｒ（２０ｐｆＩｎⅢ）０．５皿；ＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｌＩｌｅｒ２（２０ｐ，ｎｏｌ／ｔａ）０．５ｍ；１６Ｓ—ｆｒｅｅＨ２０２３｝ｄ。

反应条件：９４℃５ｍｉｎ１ｃｙｃｌｅ；９４０Ｃｌｍｉｎ，５５℃ｌｍｉｎ，７２℃

１．５ｍｉｎ，３０ｃｙｃｌｅｓ；７２。Ｃ５ｍｉｎ，ｌｃｙｃｌｅｏ

一～＋

．－

一

＋＋

一一

ｖ

注：表中“＋”表示阳性反应。“一”表示阴性反应，“Ｖ”表示可变，“ｗ”表示反应弱。

２．３２．３．１

１６Ｓ

１．２．５细菌的生理生化检测

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》峥Ｊ和《芽孢杆菌属》…】，主要依据形态及生理生化特征对分离的纯培养微生物进行分类鉴定。

１．２．６菌株产酶活力测定

将筛选菌种接种至１００ｎｄ种子培养基，于２５℃振荡培养２４ｈ，以５％的接种量接种至１００ｍｌ发酵培养基中，２５℃振荡培养４８ｈ。发酵液于３０００ｒ／ｒａｉｎ离心１５ｒａｉｎ，取上清液，按照Ｆｏｌｉｎ一酚法测定蛋白酶的活力ｕ“１２。。酶活力单位定义为：Ｉｍｌ酶液在４＆Ｃ、ｐＨ６．２条件下，每分钟水解酪蛋白产生ｌ／ｘｇ酪氨酸的酶量为一个酶活力单位（ｕ）。

ｒＲＮＡ序列分析

ｒＲＮＡ基因ＰＣＲ产物凝胶电泳分析

取５一ＰＥＲ产物进行ｌ％琼脂糖凝胶电泳，结果见图２。

１６Ｓ

２结果与分析

２．１培养基的确定

实验结果表明，在牛肉膏蛋白胨、马丁氏和高氏ｌ号培养基上筛选的微生物，有一株细菌产蛋白酶。此株细菌的菌落特征为：表面光滑、潮湿、乳白色、圆形、边缘整齐、隆起、不透

明ｆ图１）

图２

１６ｂ

ｒＲＮＡ基因Ｈ：ｊｔ产物

ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ０ｆ１６ＳｒＲＮＡ

ＤＮＡ

ｇｅｎｅ

Ｆｉｇｕｒｅ２

注：Ｍ：ＤＬ２，０００负对照。

Ｍｍｌｔ，ｅｔ；１：ＣＩ硝０９—１一ＰＥＲ产物；＋：正对照；一：

使用ＴａＫａＲａＡｇ踟１８ｅＧｅｌＤＮＡＰｕｒｉ６ｃａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｔ．２．Ｏ（ＣｏｄｅＮｏ．Ｄｖ８０５Ａ）切胶回收目的片段进行ＤＮＡ测序。２．３．２测序和序列比对

以ｓｅｑＦｏｒｗａｒｄ、ｓｅｑＲｅｖｅｒｓｅ、ＳｅｑＩｎｔｅｒｎａｌ为引物进行ＤＮＡ测

ＥＵ８１５６３５（１４５１ｂｐ）。结果表明，该细菌与Ｐ．ｐｓｅ删／ｇｅｎｅｓ

序。登陆ＮＣＢＩ网站，注册该１６ＳｒＲＮＡ序列，注册号为（ＬＭＧ１２２５Ｔ）的１６ＳｒＲＮＡ具有１００％的相似性，与Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ

ｓｔ）．Ｒ一２４２６１的部分１６ｓ删Ａ具有９９％的相似性。通过Ｍｅｇａ

围Ｊ

Ｆｉｇｕｒｅ

ｌ

筛选出的产蛋白酶细菌形态特征

Ｍ嗍山乩０９ｉｄ

ｃｌｌｍ∞ｔ枷ｃ０ｆｔｈｅｂ日ｍ耐哪一ｐＩ。ｄＩｌｃｉ唱ｐｔｏｔｅａｓｅ

４软件，对本研究的分离菌株（Ⅺ【）构建进化树。结果表明，该分离菌株与假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）在同一个分支上，也即初步推测该分离菌株属于假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｏ序列比