骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性

中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第6期 2011–02–05出版

Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research February 5, 2011 Vol.15, No.6

骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及 髓鞘的变化*★

邢红霞1，殷 闯2，王玉梅1，刘 胜3，史莉瑾1，李 杰1

Changes in astrocytes and myelin sheath in rat models of delayed encephalopathy due to acute carbon monoxide poisoning following bone marrow mesenchymal stem cells transplantation

Xing Hong-xia1, Yin Chuang2, Wang Yu-mei1, Liu Sheng3, Shi Li-jin1, Li Jie1

Abstract Xing HX, Yin C, Wang YM, Liu S, Shi LJ, Li J. Changes in astrocytes and myelin sheath in rat models of delayed encephalopathy due to acute carbon monoxide poisoning following bone marrow mesenchymal stem cells transplantation.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(6): 1035-1039. [ ]

摘要 邢红霞，殷闯，王玉梅，刘胜，史莉瑾，李杰. 骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及髓鞘的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(6):1035-1039. [ ]

期”(2 d~8周)出现一系列神经精神症状，严重0 引言 患者表现痴呆或去皮质强直，称为急性一氧化

碳中毒迟发性脑病(delayed encephalopathy 一氧化碳中毒在中国北方是常见病、多发after acute carbon monoxide poisoning，病，部分中、重度一氧化碳中毒患者，昏迷时DEACMP)。DEACMP在急性一氧化碳中毒患间超过4 h以上，在治疗清醒后经过一段“假愈

者中的发生率为12%~30%，最高达52.15%[1]。

ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 万方数据

1

First Department of Neurology, 3Second Department of General Surgery, First Affiliated

Hospital of Xinxiang Medical College, Weihui 453100, Henan Province, China; 2Department of Neurology, Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College, Xinxiang 453003, Henan Province, China

Xing Hong-xia★, Master, Associate chief physician,

Associate professor, First Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College, Weihui 453100, Henan Province, China xhxwh02@

Supported by: the Grant of Department of Science and

Technology of Henan Province in 2007, No. 072102310077*

Received: 2010-09-29 Accepted: 2010-12-26

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www.CRTER

.org 邢红霞，等. 骨髓间充质干细胞移植急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠星形胶质细胞及髓鞘的变化

新乡医学院第一附属医院，13神经内一科，普外二科，河南省卫辉市453100；2新乡医学院第三附属医院神经内科，河南省新乡市 453003

邢红霞★，女，1972年生，河南省扶沟县人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，副主任医师，副教授，主要从事神经变性性疾病研究。xhxwh02@

中图分类号:R394.2 文献标识码:B

文章编号:1673-8225 (2011)06-01035-05

收稿日期：2010-09-29

修回日期：2010-12-26(20100726007/GW·Q)

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万方数据

DEACMP持续时间长，无明确的发病机制，有人认为是由脑血管继发性病变所致[2]。病理可见脑血管扩张、瘀滞、小血管周围出血及围管性细胞浸润、脑水肿，部分小血管内皮细胞肿大，管腔变窄甚至完全闭塞[3]，从而引起神经元凋亡、坏死。亦有人认为，迟发性脑病系脑缺氧对少突胶质细胞的损害，从而影响髓鞘代谢和形成的缘故，病理可见大脑白质广泛脱髓鞘改变[4]。

近几年， DEACMP是目前临床领域急需攻克的重大难题之一。而应用骨髓间充质干细胞移植治疗DEACMP却未见报道。骨髓间充质干细胞具有向非造血组织以外的多种组织细胞分化的能力[5]，尤其是向神经细胞分化的研究更成为近年研究的热点，本实验拟在DEACMP模型大鼠应用颈动脉注射移植骨髓间充质干细胞，观察移植前后星形胶质细胞、髓鞘再生的变化。

1 材料和方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2007-12 /2010-02在新乡医学院基础医学院进行。

材料：4周龄SD大鼠若干只，雌雄不拘，体质量45~60 g，用于分离培养骨髓间充质干细胞；成年SD大鼠180只，雌雄不拘，体质量250~300 g，均由河南省实验动物中心提供，动物合格证号410116。

主要试剂及仪器：

试剂及仪器 来源

L-DMEM 培养基

美国Gibco公司 胎牛血清

(FBS) 杭州四季青生物工程

有限公司 兔抗大鼠CD44、兔抗大鼠CD34、北京博奥森生物技术

兔抗大鼠

GFAP多克隆抗体、生

有限公司 物素化羊抗兔 IgG、封闭用正常

山羊血清、荧光 FITC标记羊抗 兔IgG

荧光显微镜

尼康80I/90I

倒置相差显微镜 奥林巴斯CKX31

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养[6]：拉颈脱臼法

处死4周龄SD大鼠，置体积分数75%乙醇中浸泡5 min，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，剔除股骨和胫骨上附着的肌肉，剪断骨的两端，用D-Hank’s液冲洗骨髓腔，吹打冲洗液成单

细胞悬液，置离心管中1 500 r/min离心5 min，弃上清，加完全培养基1 mL吹打混匀，并把它加入到已有3 mL完全培养基的培养瓶中，将细胞培养瓶置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱内培养，待细胞铺满瓶底80%时加入0.25%的胰酶消化，按1∶2的比例传代。

骨髓间充质干细胞的鉴定[7-8]：

骨髓间充质干细胞的形态观察：对原代培养4 d、第1，2，3代的细胞在倒置相差显微镜下观察并拍照。

骨髓间充质干细胞表面标记物的检测：取第4代的细胞制作细胞爬片共10张，培养箱中培养2 d，取出细胞爬片以间接免疫荧光法检测，在每张爬片上随机取20个视野计算细胞总数、CD44及CD34阳性细胞数，计算CD44及CD34阳性细胞的构成比。

DEACMP的制作与动物分组：取180只模型大

鼠随机抽签法分为3组：对照组、假手术组及干细胞移植组，干细胞移植组又分为模型制备结束0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、1周移植组，每组20只。 适应性喂养1周后采用腹腔注射纯度为99.9%的一氧化碳气体方法制作动物模型，首次注射剂量为100 mL/kg，以后每隔 3 h以60 mL/kg的剂量维持，连续注射4次[9-11]。注射完毕后大鼠出现运动迟缓、睡眠增多等症状，表明动物模型成功。

骨髓间充质干细胞移植：将大鼠用10%水合

氯醛麻醉后固定在手术台上，剪毛、局部消毒、剪开皮肤、钝性分离肌肉组织，暴露颈总动脉，用玻璃分针分离出左侧颈总动脉、颈内动脉和

颈外动脉。在颈外动脉上两点结扎，从中间剪断，把消化收集到细胞浓度为1×109 L-1的骨髓间充质干细胞悬液1 mL经颈外动脉注入到颈内动脉内；假手术组用等量的0.1 mol PBS代替细胞悬液，扎闭颈外动脉，局部洒青霉素粉剂后缝皮，置笼中待苏醒后正常喂养。对照组不进行细胞移植。

取材：分别于骨髓间充质干细胞移植后第

1，2，3，4周用10%水合氯醛(400 mg/kg)深度麻醉大鼠，生理盐水灌注后，断头取脑，在视交叉处切断脑组织，标记后固定，冰冻切片。

免疫组织化学检测胶质纤维酸性蛋白表达情况：以SP法行免疫组织化学检测滴加兔抗大鼠

GFAP(1∶300)多克隆抗体，阴性对照用PBS代替一抗，4 ℃过夜后滴加二抗， DAB显色剂显色，适时终止显色反应，封固，照相。

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