羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条(2)

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中国输血杂志2004年4月第17卷第2期 ChinJBloodTransfusion,April,2004,Vol.17,No.2

1.2细胞计数 用血细胞计数器计数白细胞,加

表1悬浮液中HES浓度对沉降的影响(n=4)

2%HES

4%HES

3%醋酸并用结晶紫染色,计有核细胞数。

1.3 沉降实验 用生理盐水将HES(Sigma)配成2%~6%(w/v)的溶液,高压灭菌后备用。将HES溶液与脐血按一定体积比混匀,置于50ml离心管或沉降器(直径与离心管相同、长25cm的圆管)自然静置沉降,沉降完成后,下层(Ld)主要为红细胞团,包含少量白细胞,大部分白细胞集中在上层(Lu)段,沉降至Lu与Ld段的界面清晰后,取Lu段液体,计白细胞和总细胞数,Ld段的液体同样作计数,并由此计算白细胞收率(图1)。

脐血中白细胞数(106/ml)脐血 HES

悬浮液中白细胞数(106/ml)上层体积 下层体积

Cu(上层白细胞数)(106/ml)Cd(下层白细胞数)(106/ml)Cu/Cd

白细胞收率(%)

8.4 4.6

15ml 30ml2.8 1.535ml 10ml

3.2 1.22.6 1.21.5 1.03.5 1.42.12 0.120.74 0.1487.9 9.073.2 7.4

层白细胞密度不仅高于下层且高于混匀后密度的情

况说明,在此沉降过程中,白细胞不是单纯受重力作用而一致向下运动,而是存在向上运动。

2.1.2以悬浮液中浓度为4%的HES沉降分离后,与2%时的结果相反,其下层白细胞高于上层,而且即使悬浮液中白细胞浓度很低(0.87 106/ml),白细胞浓度仍然较高(3.2 106/ml),说明悬浮液中HES浓度过高时,红细胞之间由于桥联作用而结团过程中会夹带白细胞在其中,从而导致白细胞随红细胞团沉入下层,造成上层白细胞的损失,影响了白细胞的收率。

2.2脐血与HES溶液体积比的影响 将脐血和3%HES、6%HES溶液分别以不同比例混合均匀后沉降,考察脐血与HES的体积比对白细胞收率的影响(表2)。

2.2.1随3%HES与脐血体积比的增大,白细胞收率也相应提高,二者体积比为1 4时,红细胞通常需要很长时间(>3h)才能沉降下来,说明在0 6%的HES溶液中,红细胞不能有效地结成细胞团或结成细胞团较小,不能及时沉降实现分离;而3%HES与脐血体积比从1 2增大到5 1时,白细胞收率相应提高,但上层与下层中白细胞浓度之比Cu/Cd逐渐下降,说明随细胞占悬浮液体积比的下降,白细胞向上集中的现象越来越不明显,白细胞向上的运动相对减少。

2.2.26%HES与脐血体积比为1 4时,收率较高,此时Cu/Cd值较大,说明沉降过程中白细胞向上

x s)

6%HES

Cu/Cd1.23 0.032.79 0.462.30 0.342.12 0.121.12 0.07

悬浮液中HES浓度(%)

1.22.03.04.05.0

白细胞收率(%)82.1 4.869.1 2.752.6 6.273.2 7.479.2 10.3

Cu/Cd3.47 0.832.62 0.600.78 0.210.74 0.140.27 0.03

图1 脐血细胞沉降过程示意

1.4

标准化操作 参照纽约脐血库操作规程[2],

取6%HES与脐血以1 4混合,50g离心5min,分离得到上下层细胞液。2

结果

2.1 悬浮液中HES浓度的影响及其沉降过程的分

析 脐血沉降分离中通常采用6%HES,而不考虑其与脐血混和后的实际浓度。理论上讲,影响沉降效果的应该是混和后悬浮液中HES的浓度,因此本研究用3%和6%HES溶液分别以2 1体积与脐血混和,得到悬浮液中HES浓度分别为2%和4%,并由此研究了悬浮液中HES浓度对白细胞收率的影响(表1)。

2.1.1以悬浮液中浓度为2%的HES沉降30min后,其白细胞收率比用4%HES得到的收率高。上

表2

HES溶液与脐血体积比对白细胞回收率的影响(n=4,

3%HES

悬浮液中HES浓度(%)

1 41 21 12 15 1

0.61.01.52.02.5

白细胞收率(%)41.2 6.352.4 8.462.2 6.987.9 9.092.3 7.4