重组人骨形成蛋白2骨诱导中神经生长因子及其受(2)

目的 观察重组人骨形成蛋白2(recombined human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2)异位诱导成骨过程中神经生长因子(nerve growth factor, NGF)及其高亲和力受体(tyrosine kinase receptor A, TrkA)的表达,探讨NGF在BMP骨诱导中的作用。 方法 ICR小鼠36只,随机分

si m ilar to that of N GF.T he exp ressi on level of the mRNA of N GF du ring the cou rse of bone inducti on peaked7days after the i m p lan tati on and then decreased.Conclusion　rhBM P22 co llagen is a k ind of satisfacto ry o steo inductive m aterial,and m any differen t k inds of cells induced by rhBM P22can exp ress N GF and T rkA,w h ich suggests that N GF m ay p lay an i m po rtan t ro le in the o steogenesis in itiated by exogenou s BM P th rough direct and indirect pathw ays.

【Key words】　　Bone mo rphogenetic p ro tein　　O steo inducti on　　N erve grow th facto r　　R ecep to r　　I mm unoh istochem istry

　　骨形成蛋白(bone m o rp hogenetic p ro tein,BM P)能诱导未分化间充质细胞分化形成骨和软骨,在骨折愈合和骨修复过程中发挥着重要作用。如今已能利用基因工程技术获得重组人BM P22(recom b ined hum an bone m o rp hogenetic p ro tein2,rhBM P22),广泛应用于骨折延迟愈合、骨不连和大段骨缺损的治疗中。在骨折愈合中,除BM P的诱导成骨作用外,尚有其他众多因子的表达和参与,如转化生长因子Β(tran sfo rm ing grow th facto rΒ,T GF2Β)、血管内皮细胞生长因子(vascu lar endo thelial grow th facto r,V EGF)、胰岛素样生长因子 (in su lin2like grow th facto r , IGF2 )和碱性成纤维细胞生长因子(basic fib rob last grow th facto r,bFGF)等。神经生长因子(nerve grow th facto r,N GF)是L evi2M on talcin i于1952年发现的第一个神经营养因子,其在神经系统中调节中枢和外周神经元的生长、发育、分化和维持正常存活的作用已得到公认[1]。N GF通过其高亲和力受体(tyro sine k inase recep to r A,T rkA)发挥生理性机能。N GF及T rkA在全身分布较为广泛,已发现在骨折愈合过程中有明显表达[2],外源性N GF具有促进骨折愈合的作用[3]。我们的研究是对rhBM P22异位诱导成骨过程中N GF及T rkA的表达和N GF的m RNA在成骨过程中的表达规律进行初步观察。

1　材料与方法

1.1　实验动物及材料

健康雄性I CR小鼠36只,体重20～22g,SPF级动物房饲养(中国科学院上海实验动物中心提供)。rhBM P22胶原复合诱导材料(骨优导,含rhBM P22 0125m g 片)和胶原海绵(杭州华东基因技术研究所)。N GF兔抗小鼠多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG 以及SABC免疫组织化学试剂盒(武汉博士德公司)。R T2PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.2　动物模型制备

将小鼠随机分为实验组和对照组,每组18只。氯胺酮腹腔注射麻醉后,常规消毒,取rhBM P22复合诱导材料1 2片(含0.125m g rhBM P22)植入实验组小鼠右侧股后部肌袋中,对照组小鼠单纯植入相同大小胶原海绵。分别于术后7、14和21d各处死6只小鼠,于植入部位取材。将标本分为2分,其中1分行组织学和免疫组织化学观察;另1分行N GF m RNA的R T2PCR检测。

1.3　观察指标

1.3.1　大体观察　观察术后手术切口的愈合、肌间隙内异位成骨的大体形态及与周围肌肉组织的关系。1.3.2　组织学观察　标本采用4%多聚甲醛固定24h,14和21d所诱导骨组织采用10%ED TA脱钙液脱钙。充分水洗,逐级脱水、浸蜡,常规石蜡包埋,3Λm 连续切片,H E染色,光镜下观察。

1.3.3　免疫组织化学染色　石蜡切片经脱蜡入水后, 3%H2O2+甲醇封闭内源性过氧化氢酶,正常羊血清封闭,采用SABC法行免疫组织化学染色。抗原经微波热修复后,分别滴加N GF和T rkA兔抗小鼠多克隆抗体(1∶200),室温下孵育2h。生物素化山羊抗兔IgG 及SABC复合物各孵育30m in,各步骤间均采用0101m o l L PB S洗涤。以二甲基联苯胺显色,阳性显示为棕色,苏木素复染。采用小鼠下颌下腺组织作为阳性对照,用0101m o l L PB S替代一抗作为阴性对照。

1.3.4　R T2PCR法检测N GF m RNA表达　采用T rizo l抽提实验组标本总RNA,一步法R T2PCR试剂盒扩增小鼠N GF的c DNA,琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像处理系统分析。根据小鼠N GF的c DNA序列设计引物:N GF上游引物:5′2A TAAA GGT T T T GCCA2 A GGA CG23′,下游引物:5′2GGGGTCTA CA GT GA2 T GT T GCG23′,扩增产物长度为281bp。以32磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde232p ho sp hate dehydrog2 enase,G3PDH)作为内参照,其上游引物:5′2AA GGC2 T GT GGGCAA GG23′,下游引物:5′2GGA GA T TCA2 GT GT GGT GGG23′,扩增产物长度为469bp。琼脂糖凝胶电泳后,N GF与内参照G3PDH的m RNA条带吸光度(A)值比较,进行半定量分析。对照组未见成骨,未予R T2PCR检测。

2　结果

2.1　大体观察

术后两组小鼠均无死亡,饮食正常,未发现切口破

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中国修复重建外科杂志2006年第20卷第4期