重组人骨形成蛋白2骨诱导中神经生长因子及其受(3)

目的 观察重组人骨形成蛋白2(recombined human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2)异位诱导成骨过程中神经生长因子(nerve growth factor, NGF)及其高亲和力受体(tyrosine kinase receptor A, TrkA)的表达,探讨NGF在BMP骨诱导中的作用。 方法 ICR小鼠36只,随机分

溃、渗出,1周内伤口 期愈合。实验组术后7d,股后部植入处可扪及较硬肿块,并发现小鼠开始出现膝关节屈曲挛缩,呈现骨化性肌炎的表现;14d,肿块范围明显变大,硬度增加,与周围肌肉组织结合紧密;21d,肿块硬度进一步增加,挛缩畸形严重。对照组术后各时间点于植入部位均未见明显硬块,膝关节未见挛缩畸形。

2.2　组织学观察

实验组:术后7d,光镜下见大量成纤维细胞增殖聚集,并围绕在新生软骨前体细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞周围,伴有毛细血管和间充质细胞侵入软骨组织中,并可见由此分化而来的成骨细胞及类骨质; 14d,可见大量骨样组织和编织骨形成小梁状骨结构,可见原始骨髓腔及骨髓细胞,成骨细胞排列于骨组织表面进行造骨活动,残留的软骨细胞转变为骨样细胞,并进行骨基质的分泌、沉积和钙化;21d,骨小梁进一步成熟,并且有规则,可见有编织骨塑形为板层骨,骨陷窝清晰可见,骨髓腔内有大量骨髓细胞和脂肪滴(图1)。对照组各时间点均未见骨组织形成(图2)。2.3　免疫组织化学观察

实验组N GF的表达:术后7d,成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞、成骨细胞以及周围的成纤维细胞中均有广泛的阳性染色,在部分软骨细胞外基质中也可见阳性染色;14d,在新生骨组织表面部分成骨细胞、成骨样细胞和幼稚骨样细胞中有阳性染色,同时破骨细胞以及骨髓组织中的单核巨噬细胞和多核巨噬细胞亦呈现阳性染色;21d,阳性染色细胞进一步减少,仅在少数骨表面成骨样细胞和破骨细胞中有阳性染色,骨髓中单核巨噬细胞和多核巨噬细胞阳性表达亦减少。实验组T rkA的表达和N GF相似:术后7d可见成软骨细胞、软骨细胞、肥大软骨细胞及成骨细胞中有阳性表达;14d阳性表达局限于部分成骨样细胞、成骨细胞和破骨细胞,以及多核巨噬细胞;21d仅在少量成骨样细胞和破骨细胞中有表达(图3)。而在对照组中未见阳性染色。小鼠下颌下腺阳性对照可见腺细胞呈N GF及T rkA阳性染色。

2.4　N GF m RNA的检测

实验组术后7d,N GF m RNA表达明显,14d表达条带亮度减弱,21d仍有条带,但亮度明显减弱(图4)。内参照G3PDH m RNA在3个时间点中均有表达。

3　讨论

大量实验和临床研究[4]已证实天然BM P和rhBM P均具有显著的诱导成骨、促进骨修复的作用,尤其在骨延迟愈合、骨不连和骨缺损的治疗中。我们实验7d可见大量的成纤维细胞增殖聚集、软骨前体细胞、软骨细胞、成骨细胞和类骨组织的形成,14d可见小梁状骨以及骨髓腔、骨髓组织的出现,21d板层骨以及成熟骨髓组织形成。提示实验应用的骨诱导材料具有良好的诱导成骨能力。

　　但是骨折愈合是一个十分复杂的过程,不仅有BM P的参与,其他因子在不同时期不同环节中也发挥着重要的作用,如T GF2Β、V EGF、IGF2 和bFGF等。体外细胞培养实验中,BM P并不能诱导间充质细胞形成成熟骨组织,表明骨组织形成的过程中一定还有其他因素的参与[5]。对于神经因素在骨折愈合中作用的研究较少。研究表明,神经纤维在骨组织中的支配对骨细胞代谢相当重要。在正常骨组织中具有广泛的交感神经和感觉神经支配[6],尤其在成骨活动明显的生长板区域[7]。这些肽能神经可通过神经末梢释放相应的神经肽,作用于靶细胞来影响骨细胞的代谢[8]。

B arde[9]认为神经元通过神经纤维支配其靶组织,而靶组织细胞分泌神经营养因子以营养支配其神经元,N GF则促进神经纤维的再生和修复。F renkel (1990)首次报道鸡胚的软骨细胞和骨细胞中有N GF 的产生,认为骨痂内和其余未成熟骨组织的细胞可产生N GF,以诱导神经纤维长入胚胎骨组织和骨痂中[10]。近来在正常骨组织中也发现有N GF表达,尤其在非负重骨中的含量高于负重骨,可能与神经支配的丰富程度有关[11]。

　　在骨折愈合的过程中,新生骨组织中有N GF、脑源性神经营养因子和神经营养因子3等神经营养因子及其受体T rkA和T rkC的表达[2,3]。骨折部位应用外源性N GF具有促进骨折愈合的作用[6]。然而,在外源性BM P骨诱导过程中是否也有N GF及其受体T rkA的表达罕见报道。我们对rhBM P22胶原材料的诱导成骨过程中N GF及T rkA的表达进行免疫组织化学观察。术后7d,N GF及T rkA呈现广泛的阳性染色;

14、21d阳性染色范围和强度减少。R T2PCR结果与N GF蛋白的免疫组织化学染色结果一致。提示外源性rhBM P22诱导成骨过程中有N GF及T rkA的表达,尤其以7d最为显著。在诱导成骨过程中,N GF在局部的表达可能起着诱导神经纤维长入并支配新生骨组织的作用,从而通过一种间接途径——神经系统来作用于再生骨组织;另一方面,T rkA在诱导成骨中的表达提示N GF可能通过自分泌或旁分泌的形式作用于局部细胞,直接影响骨再生过程。

近年来研究发现N GF在全身具有广泛分布。其中N GF与免疫系统具有密切的联系,已在单核2巨噬

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・Ch inese Journal of R eparative and R econstructive Surgery,2006,V o l20(4)