丘脑束旁核_纹状体神经元轴突终末的超微结构证(2)

医学神经学

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体神经元之间主要形成兴奋性突触连接［6］，但与纹状体不同类型神经元以及与纹状体神经元不同部位（如胞体、树突和树突棘）之间确切的突触关系目前尚未定论。为此，本实验应用神经示踪和免疫组织化学技术在光镜和电镜下观察证实丘脑PFn-纹状体阳性轴突终末在纹状体内的分布规律及其超微结构特征，旨在从分布形式和超微结构方面证实丘脑PFn-纹状体神经元轴突终末与纹状体神经元之间的突触连接特征。

1

材料和方法

1．1

实验动物

正常成年雄性SD大鼠6只，体质量300～350g

（中山大学北校区实验动物中心提供）。

1．2BDA注射

动物腹腔注射氯胺酮（0．33mL／500g）和甲苯

噻嗪（0．16mL／500g）的混合液（1mL／kg），然后固定于立体定位仪（注射点依据大鼠脑图谱［7］），注射神经示踪剂BDA10K（anionic，lysinefixable，1×103

kDMW；MolecularProbes，Eugene，OR；0．1molPB配制，pH7．4）入PFn，每侧注射0．3μL，按LeiWL方法注射［3］。1．3

动物处理和切片

动物腹腔注射麻醉（3．0mL／kg体重）之后，开胸经左心室快速0．9％生理盐水冲洗，然后使用4％多聚甲醛（0．1mol／LPB配制，pH7．4）400mL灌注固定。脑取出之后4℃过夜后固定；梯度蔗糖（4℃）分别浸泡至沉底；半导体冰冻连续切片（片厚30μm），用于光镜观察实验。拟用于电镜实验的动物，在

0．9％生理盐水300mL灌注之后，继用4％多聚甲醛

（含15％饱和苦味酸及0．3％戊二醛，pH7．4）400mL灌注固定；取脑4℃后固定过夜，振动切片机连续切片（片厚40μm）。

1．4免疫组织化学和电镜组织的制备1．4．1

免疫组织化学

对于BDA注射动物的脑

片，进行ABC孵育（0．03％TritonX-100，0．1mol／L

PB，pH7．4，1∶200，Vector公司），4℃过夜；Nickel-DAB-H2O2显色，各步骤之间用0．1mol／LPB（pH7．4）洗5min／3次。其中一部分脑片进行裱片、脱

水、透明并封片，以光镜观察和计数，一部分用于电镜组织的制备，余下的脑片分别与NeuN、Darpp-32和Parv进行双标记：①分别与小鼠单克隆抗NeuN抗体（0．3％TritonX-100，0．5％BSA，1∶500，Chemicon

解剖学研究年第卷第期公司）、兔多克隆抗DARPP32抗体（0．3％TritonX-

100，0．5％BSA，0．1molPB，1∶150，CellSignaling公

司）和小鼠单克隆抗PV抗体（0．3％TritonX-100，

0．5％BSA，1∶1000，Sigma公司）双标记；上述各第Ⅰ

抗体4℃孵育36h；②室温下分别使用相应的Ⅱ抗（0．3％TritonX-100，0．5％BSA，1∶500，Chemicon公司，3h）和PAP复合物进行孵育（0．1％TritonX-100，

0．5％BSA，0．1molPB，1∶200，Sigma公司，2h）；DAB-H2O2显色，各步之间用0．1molPB（pH7．4）洗5min×3次。裱片、脱水、透明如上述。1．4．2电镜组织制备

免疫标记之后的脑片使用1％

锇酸室温后固定1小时，0．1mol／LPB（pH7．4）洗3次；梯度酒精脱水（各10min），1％醋酸铀（无水乙醇配制）1h，丙酮两遍各10min；50％包埋剂（PELCO

Eponate12TMKit）（丙酮：100％包埋剂＝1∶1）室温2h；100％包埋剂室温过夜（100％包埋剂配制：Resin31．4g，DDSA9．3g，NMA20．5g，DMP-300．8g）；将组织

块粘贴于树脂柱上，放入60℃烤箱，48h；电镜超薄切片，4％醋酸铀和0．4％柠檬酸铅染色［3］。

1．5光镜、电镜观察、计量和资料处理

纹状体按背、腹侧和内、外侧两种分区方法进

行观察和定量阳性结构。光镜高倍镜（×400）观察

PFn-纹状体轴突终末与NeuN、Darpp-32和Parv神

经元接触点数。电镜下观察阳性轴突终末结构包括测量其直径大小以及形成突触连接的形态学特征。对所获实验数据应用SPSS软件进行配对资料样本均数的t检验，P＜0．05表示差异具有统计学意义。

2

结果

2．1

丘脑PFn-纹状体阳性神经元轴突终末在纹状

体的分布特征

BDA10K被注射到丘脑PFn，以顺行标记丘脑PFn-纹状体神经元的轴突终末，注射点见图1A。对BDA标记的纹状体系列脑片（图1B）进行光镜观

察，计数各个区域的阳性终末数量，并计算各自所占的百分比。结果显示BDA阳性轴突终末在纹状体呈散在的不均匀分布，纹状体背侧区的阳性轴突终末数量最多（90．82％），结果显示具有统计意义（P＜0．001，图2），但内、外侧之间阳性纤维的数量差异无统计学意义（P＝0．387）

2．2丘脑PFn阳性轴突终末与纹状体神经元之间关系的光镜观察

在丘脑PFn-纹状体（BDA）纤维被标记之后，