脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织(5)

鲍慧婧,等.脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

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PLGA构建复合物修复角膜基质缺损,期望能建立

讨 论

组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。针对角膜的结构特点,构建组织工程角膜的方法是将体外培养扩增的细胞植附于一种可降解、生物相容性好的生物材料上形成复合物,将细胞 生物材料复合物植入受体眼角膜内,角膜细胞在生物材料逐渐被机体吸收降解的过程中,形成具有正常角膜形态和功能的新生组织工程角膜,从而实现对病损角膜的修复和重建[8]。

近年来诸多文献报道,临床上已经应用组织工程角膜上皮治疗角膜缘干细胞缺乏症。同时,能够维持正常角膜透明度的组织工程角膜内皮细胞层也已在动物模型上构建成功[12-15],而有关构建组织工程角膜基质的报道相对较少。角膜基质细胞曾被用于尝试构建组织工程角膜基质组织[16],术后角膜能够维持较好的透明度,但角膜基质细胞来源有限,增殖能力不强,且对供体角膜损伤较大。骨髓间充质干细胞由于其具有多向分化功能成为人们研究的焦点。2006年Yamagami等[19]研究显示,正常人角膜基质中存在骨髓来源细胞,尽管该研究并未明确骨髓来源细胞存在的意义,但至少说明了骨髓来源细胞参与了角膜基质的构成。2006年国内郭彤等报道人骨髓间充质干细胞移植治疗兔眼表损伤可诱导出人角膜上皮样细胞,同时,兔角膜基质中有骨髓源性细胞存在,从侧面反应了骨髓干细胞向角膜基质细胞转化的可能。但是骨髓间充质干细胞来源有限,易造成供区损伤。

ASCs由于其取材方便、来源广泛,且具有与骨髓干细胞几乎同等的多向分化能力,成为另一可供选择的种子细胞对象。Francisco等尝试将人ASCs直接注入活体兔角膜内,发现移植术后12周仍可检测到人ASCs的存在,无免疫排斥现象发生,并且免疫学检测发现在体内微环境诱导下人ASCs向角膜基质细胞转化,表达角膜基质细胞特异性蛋白聚糖keratocan。本实验室也曾应用ASCs作为种子细胞成功构建组织工程骨软骨和血管组织。PLGA为聚乳酸与聚羟基乙酸的共聚物,是一种可降解的微孔高分子材料,曾多次被作为支架材料构建组织工程化膀胱、气管等,并取得较好的效果。Hadlock等也曾应用PLGA培养视网膜色素上皮细胞和角膜内皮细胞,在共聚物膜上得到单层人视网膜色素上皮细胞和兔角膜内皮细胞,并在细胞间检测到紧密连接蛋白,证实这种可降解材料可作为载体支架培养角膜组织的有关细胞。[24-26]

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与正常角膜相似的组织工程角膜基质。

我们采用胶原酶消化法分离培养ASCs,最初从脂肪组织中分离获取的细胞团块中并不是单一的ASCs,尚含有少量其他细胞及结缔组织,其中红细胞、白细胞、淋巴细胞、内皮细胞可以于换液时逐步除去,成纤维细胞可以应用细胞差速贴壁培养法除去。经过3次传代换液后,基本可使ASCs得到纯化。在这一过程中,ASCs也不断扩增,考虑到本实验需要数量充足、功能完善的ASCs作为种子细胞,我们选择了第4代细胞构造组织工程角膜基质。为了进一步确定该方法所获得细胞是否ASCs,我们对第4代细胞进行了多向分化功能的鉴定。通过诱导rASCs向成骨、成脂和成软骨3个方向分化成功,证实我们得到的细胞确实是脂肪组织中存在的干细胞,具有多向分化功能,可以用于进一步实验。

本研究将ASCs接种到PLGA材料上,体外构建细胞 PLGA复合物,光学显微镜和扫描电镜观察结果显示,细胞能与PLGA牢固结合,细胞在PLGA材料上生长增殖良好,材料对细胞没有毒性。PLGA在活体角膜内的降解始于术后1个月,降解过程中出现角膜新生血管,但新生血管随着材料降解而逐渐消退。材料降解过程中周围角膜组织未出现水肿和排斥反应,我们推测新生血管的产生可能与手术操作的刺激因素以及材料本身有关,另外PLGA降解过程中会产生一定量的乙醇酸和乳酸,也会刺激新生血管生成。PLGA虽然具有组织相容性好、无毒、无免疫性和可降解的特性,但其作为组织工程角膜的支架材料有待于进一步改良。

角膜基质由大量胶原纤维及散在分布于胶原纤维间的角膜基质细胞构成,角膜胶原板层排列整齐,胶原纤维均一,直径约30nm,这对维持角膜透明性具有重要作用。在本实验中,我们以未接种rASCs的空白PLGA材料为对照组,将rASCs PLGA复合物回植于新西兰大白兔角膜基质缺损层,借助正常角膜所提供的上皮和内皮以及局部微环境,尝试进行角膜基质缺损的修复。结果发现:基质缺损区形成了与正常角膜类似的组织工程化角膜基质组织,并且维持了接近正常的角膜透明度。组织学检查证实,移植后第24周时,PLGA材料全部降解,新生角膜基质样组织形成,与正常角膜无明显差别。同时,应用透射电镜进一步观察显示:实验组新生角膜基质组织的胶原纤维排列规则,其直径与正常角膜基质组织差异无统计学意义。而未接种ASCs的对照组在第24周末仍未完成对缺损区的修复,遗留大部分空白缺损,只在缺损区边缘有少