脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织(3)

鲍慧婧,等.脂肪干细胞构建组织工程化角膜基质组织

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片透射电镜观察。随机(将胶原纤维编号1~600,每个编号由计算机产生随机数,将随机数字按大小排序,抽取较小的300个随机数对应的胶原纤维,测定其直径)抽取兔正常角膜胶原纤维300次和组织工程化角膜组织胶原纤维300次,测量胶原纤维直径。统计学分析 采用SPSS11.5软件统计,实验

组与对照组胶原直径的数据用x(s表示,采用方差分析和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

壁,开始伸展,5~6天细胞可达到90%的融合,传代后细胞呈成纤维细胞样梭形外观(图1A),形态均

一,生长活跃,3~4天即可达到融合。

rASCs在PLGA支架材料上的生长,增殖 扫描电镜观察,细胞接种材料后第1天可见细胞较均匀黏附在生物支架上,由圆形逐渐向两级伸展,呈梭形或多角形(图1D)。第3天可见细胞呈长梭形,分泌基质向邻近纤维支架伸展,邻近细胞相互连接,形成拉网状结构(图1E)。第7天细胞相互连接紧密,细胞表面分泌大量的细胞外基质,填充于支架材料的微孔中,细胞基质纤维支架连接成片,呈膜样结构(图1F)。细胞在PLGA支架上生长良好,

增殖明显。

结 果

rASCs生长特性 初分离的原代细胞形态呈小圆形,色深,接种3~4h开始贴壁,48h细胞完全贴

图1 rASCs,PLGA形态观与rASCs PLGA复合物扫描电镜观Fig1 MorphologyofrASCs,PLGAandSEMviewofrASCs PLGAcomplex

A:Fibroblast likeuniformshapeofrASCsatpassage4(&100);B:GrossviewofPLGAscaffoldwith7mmindiameter;C:Scanningelectronicmicrograph(SEM)ofPLGAmaterial(&500);D F:TheSEMviewofrASCsonPLGAscaffoldat1,3,7daysafterseeding(&500).

rASCs PLGA复合物在角膜基质缺损修复中的变化(图2) 术中刚移植到角膜基质层间的rASCs PLGA复合物位于角膜中央,白色不透明,1周后复合物呈现半透明,2周时见新生血管从角膜缘开始向角膜的中央复合物方向生长,并逐渐增多。4周后可见PLGA材料逐渐开始降解,12周时材料几乎全部降解,新生血管基本消失,角膜基本恢复透明。在材料降解吸收的整个过程未见引起周围角膜组织水肿及炎性反应,眼内未见其他反应。观察至24周角膜仍保持透明,与正常角膜无显著差异。PLGA组材料降解速度比实验组略慢,12周时仍有部分材料残余,24周角膜恢复透明。

组织学检查 rASCs+PLGA组术后第12周,PLGA支架材料降解完全吸收,HE染色可见新生,生胶原间,沿胶原方向伸展,新生胶原与角膜表面基本平行,排列较为整齐,新生组织与周围组织染色相似(图3A1)。PLGA组缺损区域可见明显空缺,极少量新生角膜基质组织生成(图3B1)。术后24周,rASCs+PLGA组新生角膜基质样组织排列更为规则,板层胶原纤维与前后或上下邻近的纤维相互吻合,形成交叉网状结构(图3A2),与正常角膜几乎无差异。新生组织周围基质未见明显炎症细胞浸润,无角膜水肿。PLGA组损伤部位边缘有少量纤维生成,仍有明显缺损区存在(图3B2)。

透射电镜检查结果(图4) 术后第12周rASCs+PLGA组新生胶原排列基本规则,部分区域可见胶原间距增大(箭头所示),第24周新生胶原纤维直径均一,排列规则,呈典型板层排列,与正常角膜纤维排