酵母双杂交实验流程(2)

X- -Gal和X- -Gal使酵母变蓝。其中， -半乳糖苷酶是外分泌酶，在酵母表面就能直接检测到； -半乳糖苷酶是内分泌酶，需要将酵母破碎后才能检测到。用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用的方法不仅具有较高的敏感性，而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。

随着酵母双杂交系统的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进，除了经典的双杂交系统以外，同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、hSos/Ras募集系统（hSos/Ras recruitment systems）、泛素分裂系统（Split-ubiquitin systems）、双诱饵系统（Dual-bait systems）等一系列相关系统，根据这些系统的不同特点，可以分别应用于蛋白质与DNA、RNA的相互作用、蛋白质复合体之间的相互作用、膜蛋白质之间的相互作用、筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域，对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充，并有力地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。

酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）和转录激活结构域（activation domain, AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性，将BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合，构建出BD-X质粒载体；将AD 基因与cDNA 文库，基因片段或基因突变体（以Y表） 融合，构建AD-Y质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如LacZ，HIS3，LEU2）等 的表达（图6-1-2），使转化体由于HIS3 或LEU2 表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ 表达而在X- -Gal 存在下显蓝色。

3. 实验仪器

微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1,000 μL）、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿。 4. 实验试剂

（1）裂解缓冲液（Cracking buffer）： 尿素 SDS

Tris-HCl（pH 6.8）

8 mol/L 5 % 40 mmol/L 酵母双杂交原理示意图

EDTA 溴酚蓝

0.1 mmol/L 0.4 mg/ml

（2）各种基础培养基和营养缺陷培养基：minimal SD base，minimal SD agar base，YPD medium，YPD

agar medium，-Leu DO supplement，-Trp DO supplement，-Leu/-Trp DO supplement，-Leu/-Trp/-His DO supplement，-Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement，腺苷酸（adenine），PEG8000，Carring DNA，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO），TE/LiAC buffur，PEG/LiAC，X- -gal或X- -gal。 （3）酵母质粒提取试剂盒，LB培养基，羧苄青霉素和卡那霉素。 （4）蛋白标准。 （5）Z-buffer（pH7.0）：

Na2HPO4 7H2O NaH2PO4 H2O KCI

MgSO4 7H2O

（6）Z-buffer/X- -Gal液体： Z-buffer -巯基乙醇 X- -Gal储存液

100 ml 0.27 ml 1.67 ml

5. 实验方法

酵母的复苏与表型验证：

（1）复苏前1~2 天，配制YPDA 琼脂并于高压消毒后倒板。

（2）用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞，接种到YPDA 琼脂板上。 （3）30 ℃倒置孵育3~5天。

（4）待酵母长到直径2~3 mm后，将其接种到不同营养缺陷型培养基上进行表型验证。 质粒转化酵母细胞（常规转化）：

（1）挑取一直径约2~3 mm的酵母克隆接种到0.5 ml YPDA培养基中。 （2）剧烈震荡使细胞凝块均匀分散。

（3）将细胞转移到含有新鲜YPDA培养基的锥形瓶中。

（4）30℃，250 rpm，振荡孵育16~18 hr，直到稳定期（OD 600>1.5）。

（5）将过夜培养物转移到含有新鲜YPDA培养基的椎形瓶中，进一步扩增酵母细胞。 （6）30 ℃，230~270 rpm，振荡孵育使OD600达到0.5 0.1（一般需要3 hr） （7）将细胞转移到数个50 mL离心管中，转速1 000 g，室温离心5 min。

16.1 g/L 5.5 g/L 0.75 g/L 0.246 g/L