酵母双杂交实验流程(4)

1.5 mL的EP管。

（6）按80 L/7.5 OD600的比例向EP管中加入酸性玻璃微珠（glass beads）。70 ℃加热10 min。剧烈

震荡1 min。

（7）12,000 g，4 ℃离心5 min。将上清转移到一个新的1.5 mL EP管中，置于冰上。 （8）100 ℃水浴中3~5 min，剧烈震荡1 min。

（9）12,000 g，4 ℃离心5 min。将两次上清合到一个EP管中。 （10）取20 L上清，加入上样缓冲液，100 ℃变性5 min。

（11）SDS-PAGE电泳后，采用Western blot技术检测目的蛋白在酵母细胞中的表达情况。 小规模酵母杂合（mating）：

（1）在无菌的1.5 mL EP管，加入0.5 mL 2 YPDA培养基。

（2）挑取直径约2~3 mm、新鲜的含有表达质粒pGBKT7-X的AH109酵母克隆和含有表达质粒

pGADT7-Y的Y187酵母克隆于上述EP管中。 （3）剧烈震荡1 min，使酵母细胞完全悬浮。 （4）30 ℃，200 rpm振摇孵育20~24 hr。

（5）将杂交混合液按1:100稀释到0.5 YPDA培养基中，取100 mL铺到SD/-Trp/-Leu/X- -Gal板上。 （6）倒置平板于30 ℃孵育直到克隆出现。

-Gal

Mating Y187 AH109 SD/-Ade/-Leu/-Trp/ X- -Gal SD/-His/-Leu/X- -Gal

酵母杂交操作步骤流程图

滤纸转移法检测 -半乳糖苷酶的分泌：

（1）待酵母长到直径1.5~3 mm大小时，取无菌、大小合适的Whatman滤纸贴在酵母板上。 （2）待滤纸被琼脂板上的水分基本浸湿后，揭下滤纸，这时酵母克隆被转移到了滤纸上。 （3）将附着有酵母克隆的滤纸在液氮中速冻10 sec以上。

（4）将新配制Z-buffer/X- -Gal液体滴在另一无菌的Whatman滤纸上，并完全浸湿滤纸。