酵母双杂交实验流程(3)

（8）弃去上清，加入25~50 mL消毒H2O，振荡重悬、清洗并收集细胞。 （9）转速1 000 g，室温离心5 min，弃上清

（10）加入1 mL新鲜配置的无菌的1Х TE / LiAC重悬细胞。

（11）准备1.5 mL无菌EP管，在每个管中加入需要转染的质粒以及担体（carrier）DNA。

质粒DNA carrier DNA

小量转化 0.1 g 0.1 mg

大量转化 20~200 g 2 mg

（12）加入经1Х TE/LiAC重悬的感受态细胞，轻柔混匀。

（13）每个管中加入适量体积的1 PEG/LiAC，高速震荡混匀。 （14）30 ℃，200 rpm，振荡孵育0.5 hr。

（15）加入适量体积的DMSO，温和颠倒混匀，不要振荡。

（16）42 ℃水浴热休克15 min，对于大量转化，应经常摇动以混匀。 （17）置于冰上5~10 min，室温12,000 g离心细胞5 sec。 （18）移去上清，根据铺的板数加入适量体积的1 TE重悬细胞。 （19）铺板，倒置平板于30 ℃孵育直到克隆出现。

转化酵母菌结果 质粒

*7 每管中加入感受态细胞的体积根据酵母细胞的数量以及铺板的大小而定，通常小量转化每管加入100 L 的感受态细胞；大量转化每管加入1 mL 的感受态细胞。如果长出来以后克隆太密则可适量减

少每管中加入的感受态细胞的体积；反之则可适当增加感受态细胞的体积。

检测目的蛋白在酵母细胞中的表达：

（1）挑取一直径约2 mm、含有目的蛋白基因片段的BD/X新鲜酵母克隆于5 mL 相应营养缺陷液体

培养基中，30 ℃、230 rpm振荡孵育16 hr。

（2）将过夜培养物在50 mL YPDA培养基中扩大培养，30 ℃，220~250 rpm，使OD600值达到0.4~0.6。 （3）1,000 g离心5 min，弃上清。

（4）加入30 mL H2O，重悬细胞。1,000 g，离心5 min，弃上清，加入液氮速冻沉淀。

（5）待液氮挥发完全以后，按照100 L/7.5 OD600的比例加入cracking buffer重悬细胞并移入到一个