酵母双杂交实验流程(7)

文库滴度的测定：

（1）将预留的10 L文库与10 L LB混合均匀。

（2）取1 L混合液到1 mL LB培养基中，混合均匀，制成稀释溶液A（1:103）。 （3）再从溶液A中取1 L到1 mL LB培养基中，混合均匀，制成稀释溶液B（1:106）。 （4）从溶液A中取1 L到50 mL LB培养基中，混合均匀，铺板。 （5）从溶液B中分别取50 L和100 L铺板。 （6）将板倒置30~31 ℃，孵育36~48 hr。

（7cfu/mL），计算文库滴度的方法如下：

A：克隆数 10 2 = cfu/mL

B：（克隆数/铺板体积） 103 103 103 2 = cfu/mL 6. 注意事项

（1）酵母双杂交对照的设定

常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4酵母双杂交筛选系统为例：

阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。

阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。

系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起 -半乳糖苷酶和 -半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。 （2）假阳性现象

多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：

筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。

酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。这种情况需要对阳性克隆再次划板2~3次，以确保每一个酵母克隆中只含有一种文库蛋白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。

其他一些不明原因造成的假阳性—这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新共转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒的载体对调构建成pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。 （3）常见的问题及参考方案

转化效率过低—尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在2~3 mm左右的酵母克隆，以

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