感受态大肠杆菌制备方法(3)

感受态细胞的制备

8、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。

1.液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌TOP10,JM109等,在LB平板上划线,37度过夜至长出单菌落.

2.挑直径1-3毫米的单菌落,可多个,接种到250毫升/3升锥形瓶或80毫升/1升锥形瓶的SOB培养基.培养基量不可再多,会影响效率.

3.在18℃150-250rpm培养19-50小时没有冷却摇床的可在室温,但不可高于37度.

4.OD600约0.4-0.8时停止培养,放在冰水中冷却10分钟

5.4℃,300RPM离心15分钟,回收菌体

6.去掉上清后,用1/3体积的冰冷TB溶液悬浮,在冷10分钟

7.再次离心回收菌体

8.用1/12.5体积的TB悬浮,添加最终浓度为7%的DMSO,再冷却10分钟

9.0.1-1毫升分装,直接在液氮中冻上.

10.在液氮或-80℃保存.

（1）将置于液氮保存的大肠杆菌划线在LB平板上，37℃培养活化。

（2）挑取经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基，18℃，200-250rpm培养。

（3）当OD600=0.5-0.8时，用预冷的40mL离心管于4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

（4）用预冷的TBBuffer重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。

（5）重复第4步操作。

（6）用8mL预冷的TBBuffer重悬菌体，缓慢加入DMSO至终浓度7%。

（7）冰浴10min后，分装保存于液氮中。

高效感受态细胞制作

1.单菌落-------2mlLB37度120RPM过夜------1%转接-------37度200RPM2小时(OD到