感受态大肠杆菌制备方法(4)

感受态细胞的制备

0.4~0.5)

2.2ml,冰浴15min,4度,6000RPM5min,弃上清,悬浮于1ml0.1MCaCl2中,冰浴20min

3.4度,6000RPM10min,重悬浮于200ul0.1MCaCl2中,冰浴30min

建议用TSS法，简单方便，比氯化钙法的转化效率高.别的菌可能不一定适用。

以下为转贴，具体方法请最好查阅文献。

E.coli感受态细胞制备方法:

单菌落平板至2mlLB,37℃250r/m,1ml转至50mlLB,37oC250r/m至A600=0.2-0.4

离心后用10毫升TSS重悬后,分装-70oC保存。尽量冰上操作.

转化:加质粒(<5ul/100ulcell)后冰上30分钟，42℃90秒，冰上2分钟，加LB至1ml,37℃1小时后铺抗生素平板。

TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）

一、准备工作

1、缓冲液1×TSS的配制：事先配制1M的氯化镁——20.3g氯化镁(6分子水结晶)/定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

2、取干净的100ml量筒和100ml烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10gPEG(MW=3350),5mlDMSO，5ml的1M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um滤器过滤除菌。储存在4℃，保质期约6个月。

2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种——Dh5α，用于接种并振荡培养。.两个锥形瓶，分别装有30ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。

3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种。其余做转化用。

二、感受态制备程序：

1、前一天晚上调单菌落至30mlLB中过夜培养（12-16h）,按1：100比例将过夜培养的菌液