聚合酶链式反应技术(PCR)(13)

聚合酶链式反应技术

能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。

（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。

模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。

（七）引物：引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15～30个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。

引物G C约占45～55%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。

PCR反应条件的选择（影响因素）

温度参数：

1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。

2.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。