聚合酶链式反应技术(PCR)(3)

聚合酶链式反应技术

7 杂交捕获

Digene公司建立起来的这种方法的原理是将DNA-RNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合，由标记AP的抗体介导产生化学发光信号。被FDA批准的该类型试剂盒有淋球菌、沙眼衣原体和巨细胞病毒，并且是唯一被批准用来检测人类乳头瘤病毒DNA（HPV-DNA）的试剂盒。

8 DNA裂解信号放大

在环状探针技术中（cycling probe technology, CPT）,探针为一含DNA-RNA-DNA的嵌合体，两端分别标记生物素与荧光蛋白，结合到靶核酸上后，RNA部分被RNA酶（H）降解，两端DNA部分脱落下来，同时靶核酸可继续用来结合探针。反应后的体系在包被有链亲合素与蛋白G抗体的高流速硝酸纤维素膜上层析，如果没有靶核酸存在，完整的探针结合上胶体金-抗荧光蛋白接头，被包埋的链亲合素捕获后产生一条检测线，反之则没有。最近该技术有用于耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌与耐万古霉素的肠道微球菌的检测。

侵染探针（Invader）技术为另一种DNA信号放大分析。它是依据AFEN1酶的酶切特性来设计上、下游引物，上游引物的全部序列与下游引物（信号探针）的3´部分序列可与靶核酸的一段连续序列杂交结合，这样下游引物的5´端就如同在上游引物的侵入下而呈翼状探出，进而被FEN1酶切下，分析酶切片段可确定有无靶核酸的存在。Hall等人使酶切下来大片段与按同样原理设计的分子灯标结合，后者经FEN1酶切后荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。其检测灵敏度可达1000拷贝（靶核酸）以下。

该技术还可应用于单核苷酸多态性分析（single nucleotide polymorphism,SNP）,因为碱基错配可抑制FEN1的酶切。用于基因突变的研究报道结果与等位基因特异性PCR一致。

9 滚环扩增（RCA）

RCA既可进行靶核酸扩增，也可进行信号放大扩增。有线性与指数两种形式的RCA。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸。产物是具有大量重复序列（与环状DNA完全互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。

Schwetizetr等人建立了免疫RCA，引物的5´端标记有抗体，抗原抗体反应后，加入RCA反应组分与环状DNA模板进行RCA，然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交，最后对荧光信号进行检测，该方法的灵敏度可达0.1pg/ml。

指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。Thomas等人证实其灵敏度可达到10拷贝，在1h内产物达107倍。

指数RCA可用于非环状DNA的扩增，设计一引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶作用下，引物被连接成环状。

此环状引物可作为RCA的模板，进行指数扩增。此方法特异性很高，可用于突变与SNP的检测，若与荧光实时检测系统结合起来，其应用前景将是很广的。

10 纳米颗粒（nanoparticles）

纳米材料是具有纳米介观尺度（0.1-100nm）的均匀的有机或无机分子。按一定方法合成的均匀的胶体金颗粒在该领域一直是倍受青睐的，此纳米粒子在免疫标记领域已占有一席之地，并发挥着巨大的作用。

胶体金颗粒可与生物大分子表面的还原性的疏基结合。人工合成的寡核苷酸探针经疏基修饰后就可被胶体金颗粒标记上，可用于固相核酸杂交的信号显示。液相杂交中，通过胶体金标记的寡核苷酸探针与靶核酸的结合，使得胶体金颗粒聚集在一起而呈现颜色反应，根据颜色变化可判断靶核酸的存