基于HLA组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可(3)

背景：传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,产生了大量的模棱两可难题,而采用基于组特异性单倍体全长测序分型方法来解决模棱两可结果的确认定型鲜有报道。目的：分析基于组特异性单倍体全长测序分型方法对HLA基因分型模棱两可结果准确定型的效果。方法：对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于等位基因全长单倍体的Sanger测序(PCR-SBT)分型。

王宋兴，等. 基于HLA 组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可结果的准确定型 P .O. Box 10002, Shenyang 110180

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后吸弃上清液。加入体积分数70%乙醇200 μL/孔洗涤第1次，磁珠吸附1 min 后吸弃上清洗液。再加入体积分数70%乙醇200 μL/孔洗涤第2次，磁珠吸附1 min 后完全吸弃上清液。室温静置20 min 待乙醇完全挥发后，加入ddH 2O 40 μL/孔溶解产物，吹打混匀。静置5 min 后置于磁力架上，纯化产物即完全溶解在上清ddH 2O 中。磁珠吸附2 min 后吸取上清液到新的反应孔中。纯化后产物可以在-20 ℃保存15 d 。 1.4.4 HLA 位点测序反应 根据HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)A 位点测序引物信息表(表1)和HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)C 位点测序引物信息表(表2)提供的测序引物信息，选择每个位点相应的测序引物，根据4.5 μL ddH 2O 、1 μL 测序引物、0.5 μL 测序混合液、2 μL 5×测序缓冲液配置总体积

为8 μL 测序反应体系混合液。加2 μL 的纯化后的PCR 产物至相应的反应管中，使最终测序反应体积为10 μL 。充分混匀测序反应体系混合液，短暂离心后，置于PCR 仪样品孔上。测序反应程序：98 ℃ 2 min ；96 ℃ 10 s ，50 ℃ 5 s ，60 ℃ 2 min ，共30个循环；4 ℃ 保存。测序反应完成后，进行测序反应产物的纯化。测序产物可以在2-8 ℃过夜保存。

1.4.5 测序反应产物纯化 每孔测序反应产物中加入2 μL NaAc/EDTA 和25 μL 无水乙醇，充分振荡混匀，室温放置15 min 。2 000×g ，离心30 min 。倒置反应板，100×g ，离心1 min 。每孔测序反应产物中加入50 μL 体积分数80%的乙醇，2 000×g ，离心5 min 。倒置反应板，100×g ，离心 1 min 。每孔内加入甲酰胺15 μL ，95 ℃，变性2 min ，变

表1 HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)A 位点测序引物信息表 Table 1 HLA-A sequencing primers of Full-length Sequencing Kit (Group-specific Haplotype PCR-SBT Method)

Specificity Mix Sequencing primer Direction Region / Comment A*01, *36

MSA101

SA01 FW EX1 - I2 Standard

SA02 REV EX1 - I1 - E2 SA03 FW I1 - EX2 - I2 - EX3 SA04 REV EX1 - I1 - E2 - I2 SA05 FW I2 - EX3 - I3 SA06 REV EX2 - I2 - EX3 - I3 SA07 FW I3 - EX4 SA08 REV EX3 - I3

SA09 FW I3 - EX4 - I4 - EX5 - I5 SA10 REV I3 - EX4 - I4

SA11 FW I4 - EX5 - I5 - EX6 - I6 SA12 REV EX4 - I4 - EX5 - I5 SA13 FW I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 SA14 FW EX6 - I6 - EX7 - I7 - EX8 SA15

REV I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 - EX8 A*02, *68, *69, *80 MSA102

Standard

SA16

FW EX4 - I4 - EX5 - I5 instead of SA09 if A*80 is present If individual is A*02,*68 use mixes MSA103 and MSA104

A*02, *69, (*68) MSA103 Standard In few instances coamplification of A*68 A*01,*30 *36, *68, *69, *80 MSA104 Standard

SA16 FW EX4 - I4 - EX5 - I5 instead of SA09 if A*80 is present A*23, *24 MSA105 Standard A*31, *33

Except A*33:07

MSA106 Standard

SA17 REV I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 instead of SA15 A*29, *32, *74 MSA107 Standard

SA17 REV I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 instead of SA15 A*03, *30 MSA108

Standard Gene up to intron 7

SA01 FW EX1 - I2

Cannot be used, primer not included in PCR product SA18

REV I4 - EX5 - I5 - EX6 - I6 instead of SA15 If individual is A*03,*30 use mixes MSA109 and MSA110

A*01, *02, *03, *11, *36, *68, *69, *80

MSA109 Standard

SA16 FW EX4 - I4 - EX5 - I5 instead of SA09 if A*80 is present A*30

MSA110 Standard A*11 MSA111 Standard A*29, *80

MSA112 Standard

SA16 FW EX4 - I4 - EX5 - I5 instead of SA09 if A*80 is present A*25, *26, *29, *31,

*32, *33, *34, *66, *74,*43? MSA113 Standard

SA17 REV I5 - EX6 - I6 - EX7 - I7 instead of SA15 Heterozygous

MSA114

Standard