基于HLA组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可(6)

背景：传统的HLA测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增,由于HLA多样性高,产生了大量的模棱两可难题,而采用基于组特异性单倍体全长测序分型方法来解决模棱两可结果的确认定型鲜有报道。目的：分析基于组特异性单倍体全长测序分型方法对HLA基因分型模棱两可结果准确定型的效果。方法：对2例模棱两可结果标本以低分辨率分型方法结果作为参考起点,通过组特异性扩增分离,基于等位基因全长单倍体的Sanger测序(PCR-SBT)分型。

王宋兴，等. 基于HLA 组特异性单倍体全长测序方法对模棱两可结果的准确定型 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

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2 结果 Results

2.1 HLA 组特异性单倍型全长测序分型方法解决A 位点模棱两可结果 标本1低分辨试剂盒扩增第2，3，4外显子得出的结果为A*02∶03杂合A*11∶01(图1)，但有1个不匹配位点，疑似新基因。根据HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)A 位点测序引物信息表(表1)用MSA102扩增A*02， MSA111扩增A*11，扩增产物电泳图分别如图2中第1、2泳道所示，然后进行测序分析得出分型结果为A*02∶03∶01杂合新等位基因，该基因与A*11∶01∶01∶01全长比较，在NT817由C 发生突变为T(图3)，由于其发生在第三外显子上，故引起第125位密码子由GCC 变为GTC ，从而引起其编码的氨基酸由脯氨酸变成缬氨酸。

2.2 HLA 组特异性单倍型全长测序分型方法解决C 位点模棱两可结果 标本2低分辨试剂盒扩增第2，3，4外显子得出的结果为C*08∶01杂合C*07∶373(图4)，但C*07∶373在中国汉族人群中是一个相对罕见的等位基因；而图4中右侧黄色背景结果C*07∶02杂合C*08∶01为常见等位基因，虽有一个错配碱基，疑似新基因。根据HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)C 位点测序引物信息表(表2)用MSC306扩增C*08， MSC308扩增C*07，扩增产物电泳图分别如图2中第3、4泳道所示，然后进行测序分析得出分型结果为；C*07∶02∶01∶01杂合新等位基因，该基因与C*08∶01∶01比较，在NT879由A 发生突变为G(图5)，由于其发生在第三外显子上，故引起第144位密码子由CAG 变为CGG ，从而引起其编码的氨基酸由谷氨酰胺变成精氨酸。

3 讨论 Discussion

HLA 是存在于人类基因组中最多态的基因系统之一。HLA 的功能分子消除外来入侵者是复杂的移植。HLA-A ，-B ，-C ，-DRB1和-DQB1在等位基因水平被认为是对干细胞移植效果有重要作用[9-10]。此外，最近的研究表明，在允许和不允许错配的细胞间相互作用的基础上，DPA1和DPB1匹配可能在供体干细胞正确移植中起重要作用[11-13]。研究也表明HLA-DRB1等位基因高分辨率分型与脐带血移植有相关性[14]，目前正在研究评估其他等位基因位点高分辨率分型的需要。由于HLA 的高度多态性，在等位基因水平上基于测序的分型技术(SBT)已经是并且仍然是金标准，测序能够呈现等位基因核苷酸全长序列。虽然肽结合槽外的多态性与临床是否存在相关性还没定论，但是等位基因的识别取决于全基因多态性和超高分辨率分型结果很毫无疑问的。IMGT 3.9.0数据表明，HLA-Ⅰ类除了第2和第3外显子，第1，第4和第5外显子也具有高度多态性水平。

在HLA 组织配型产业领域，目前国际市场中的产品都只针对HLA 基因的部分外显子进行分型，如只对HLA Ⅰ类基因的2，3，4三个外显子进行分型检测，而实际上HLA-

Ⅰ类全长基因总共含有7个外显子，因此若HLA 单核苷酸多态性位于该两种试剂所检测外显子以外的区域，便很容易产生模棱两可无法判定的结果。目前的HLA 分型产品模棱两可比例高达40%-60%[15]。另一方面，目前市场上HLA 的分型产品PCR 扩增引物设计的都是通用的，很容易产生部分等位基因的漏检。最后，传统的HLA 测序分型技术都是对父系母系双倍体进行扩增，由于HLA 多样性高，密度极高的杂合子峰增加了软件开发和结果分析的难度和时 间[16-23]。在2008至2009年，作者的合作方荷兰马斯特里赫特大学医学中心免疫移植和组织配型实验室统计发现，通过杂合SBT 模棱两可的结果百分比分别为HLA-A 66%，HLA-B 71%，HLA-C 58%，在所有这些情况下必须附加测序以获得明确的定型结果。

所谓的HLA 模棱两可结果产生的原因可分为两类，一是等位基因的差异碱基位于测序范围之外；二是测序范围内不同等位基因碱基序列的组合可以获得相同的杂合序列。本文中的低分辨结果HLA-A*02杂合HLA-A*11就属于第一类，而HLA-C*08杂合HLA-C*07：373就属于第二类。目前用于解决HLA 基因分型模棱两可的方法有主要有PCR-SSP 法、GSSP 、GSA 、基因克隆测序法、单倍型分离法、焦磷酸测序法、参照链介导构象分析法(RSCA)等实验性方法，此外还有非实验性的统计学方法[24]。有研究表明，下一代测序(NGS)方法可用于整个基因组的测序[25-31]。但是NGS 可获得的目标序列长度有限、有序列连接错误的可能以及耗时长等主要缺点使得NGS 不太适合于常规诊断分型[32-33]。虽然实验方法是解决模棱两可分型结果的直接手段，但各种实验方法都会一定程度上增加分型成本、延长分型时间，不利于其在大规模供者HLA -直接测序分型中的应用。由于HLA 等位基因的分布具有种群、地理差异性，同时大部分新发现等位基因仅存在于少数群体而且频率较低[34-35]，因而根据等位基因频率进行非实验鉴别模棱两可分型结果成为一种可能。美国国家骨髓库(NMDP)制定的“罕见等位基因排除法则”规定可以直接排除模棱两可等位基因组合中的一个或两个均为罕见等位基因的组合。按照NMDP 的规定：频率<1/5万的HLA-Ⅰ类等位基因和频率<1/10万的HLA-Ⅱ类等位基因为罕见等位基因[36]。那么，在分析分型结果时也应综合考虑大规模群体HLA 等位基因分布数据和罕见等位基因。

在本文中，根据HLA 全长测序分型试剂盒(组特异性单倍型PCR-SBT 法)A 位点和C 位点测序引物信息表分别用MSA102扩增A*02， MSA111扩增A*11，MSC306扩增C*08， MSC308扩增C*07，扩增产物电泳图显示扩增效果好，然后测序分析得出第1例模棱两可分型结果为A*02∶03∶01杂合新等位基因，该基因与A*11∶01∶01∶01全长比较，在NT817由C 发生突变为T ，由于其发生在第三外显子上，故引起第125位密码子由GCC 变为GTC ，从而导致其编码的氨基酸由脯氨酸变成缬氨酸；第2例模棱