蛋白质组学答案终稿(6)

山师限选课答案

1）考马斯亮蓝染色凝胶的脱色

用50% 乙腈/25mM NH4HCO3 脱至背景无色（也有用50%甲醇）

2）银染凝胶的脱色

30 mM 铁氰化钾与100mM 硫代硫酸钠用前1：1混合。脱至无淡黄色溶液产生，吸去溶液，加ddH2O

冲洗。

脱色后的胶块用100%乙腈脱水后，真空离心干燥20~30min

15，一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法

含氮有机物与浓硫酸共热,即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

H2NCH2COOH+ 3H2SO4 ? 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)

2NH3 + H2SO4 ? (NH4)2SO4 (2)

(NH4)2SO4 + 2NaOH ? 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。

二、双缩脲法（Biuret法）

蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，此紫色络合物颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1～10ug蛋白质。,

三Folin—酚试剂法（Lowry法）

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。

四、紫外吸收法

由于蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度与蛋白质含量成正比，可用作定量测定。

五、考马斯亮兰法（Bradford法）

考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。

16，二维凝胶电泳基本原理

第一向是等电聚焦，根据蛋白质等电点(pI)不同的分离

第二向是SDS-PAGE，根据蛋白质分子量不同的分离。

一般采用垂直电泳或水平电泳，两者差别不大，均适于分子量10-150kd的蛋白质。