蛋白质组学答案终稿(9)

山师限选课答案

1. prey蛋白的非特异性结合

2. 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录（这是大多数假阳性的诱因）

（2）噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。

优点

1. 高度选择性

2. 可以构建大的噬菌体文库（109~1010），亲和纯化可在高浓度下进行（大于103噬菌体

/ml）

3. 通过改变洗脱步骤的严格性，来评价融合蛋白结合的特异性。

缺点：1. 多价展示对于肽段大小的限制2. 蛋白质能被细菌分泌3. 体外实验，蛋白质在

细菌内无法正确折叠4.融合蛋白会影响蛋白本身的活性

(3)蛋白质亲和层析（Pull-down)

在一定的条件下，某种蛋白质共价连接在基质如琼脂糖上，用以结合抽提物中 能与该蛋白结合的配体蛋白。

先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，再用高盐溶液或SDS洗脱下结合在柱子上的蛋白质。 蛋白质需要纯化，通常简单方法是构建融合蛋白，常用的谷胱甘肽S转移酶（GST)，可用谷胱甘肽-琼脂糖柱纯化；Staphylococcus 蛋白A在IgG柱上纯化；含His6-Tag的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可在含直链淀粉的柱子上纯化。

优点:(1)灵敏度高，在高浓度固定蛋白质条件下 可检测微弱的相互作用（结合常数：10-5mol/L, 生理上相关的最微弱的相互作用在10-3mol/L)

(2) 可以同时检测抽提物中所有的蛋白，它们结合机会均等

(3) 通过构建突变体，可以检测与特异性相互作用有关的蛋白质结构域或关键的氨基酸残基

(4) 检测多亚基蛋白质间的相互作用假阳性：

（1）电荷间的相互作用使蛋白质与检测蛋白质结合，可以利用带相同电荷的对照柱来消除

（2）通过B蛋白，A蛋白与检测蛋白间接结合

（3）两种蛋白质的细胞定位不同，但在认为条件下，却能高特异性结合。

(4)免疫共沉淀

原理: 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

优点（1）检测细胞裂解原液中所有蛋白质与检测蛋白质的相互作用

（2）抗原、抗体相互作用是在生理浓度下被检测的，可排除过量表达带来的假阳性。

（3）可检测到体内形成的天然复合体

（4）天然蛋白质如果经过翻译后修饰，可以检测到依赖于或不依赖于修饰的蛋白质相互作用 缺点：

（1）有时免疫共沉淀的蛋白质并非直接相互作用

（2）灵敏度不高：抗原浓度低

(5) 化学交联法

如果两种或两种以上蛋白彼此间存在特异性的亲和性并在生物体内可以形成复合物，可以用该法研究这种相互作用，尤其是瞬时相互作用。

使用一种交联试剂，并且在交联试剂的光激活部分带有标记，将该试剂共价耦联到一蛋白质上，耦联物与抽提物一起温育。若抽提物中的A 蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用，光激活后交联剂的一部分就结合到A 蛋白上。加入还原剂，切割交联试剂，使A 蛋白带有交联剂上有标记的部分，然后通过凝胶电泳等方法分析该蛋白。