砧用南瓜种质资源形态学性状与SSR标记分析(4)

1382 园 艺 学 报 41卷

1.2 植物基因组DNA的提取与PCR扩增

2013年9月，在南京农业大学生科楼的塑料拱棚内进行穴盘基质育苗，每个品种30株。幼苗

一叶一心时取第一片真叶，每品种取样10株。样品液氮速冻后，贮存于–80 ℃冰箱内待用。

采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305-03（天根生化科技有限公司）提取叶片总DNA。1%

琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，epporf Bio Photometer plus核酸分析仪测定样品DNA浓度，稀释

至50 ng · µL-1备用。

选取144对SSR引物（由Oligo公司合成）进行特异性引物筛选（Gong et al.，2008；王冬杰，

2013），选用5个差异较大品种的DNA作模板。选择条带清晰、有差异带和重复性好的引物，用于 全部砧用南瓜样本的分析。

PCR反应体系为20 µL，包括：50 ng · µL-1 DNA模板1.0 µL，10 × Ex Taq Buffer（Mg2+ free）

2.0 µL，25 mmol · L-1 MgCl2 1.5 µL，2.5 mmol · L-1 dNTP Mixture 1.6 µL，10 µmol · L-1正反向引物各 1.0 µL，2.5 U · µL-1的r Taq 0.2 µL，以及ddH2O 11.6 µL。溶液分装在eppendorf epMotion 5070移液 工作站上进行。PCR扩增在Biorer Life Express PCR仪内进行，程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性1 min，退火（温度随引物的不同而改变）1 min，72 ℃延伸1 min，38个循环，72 ℃延伸10 min 后立即置于冰水混合物中，冷却后置于4 ℃冰箱中保存待测。采用JY-JX7垂直电泳槽（北京君意

东方电泳设备有限公司制造），在8%非变性聚丙乙烯酰胺凝胶中对扩增产物进行电泳分离。电泳结 束后银染，用GE Image Scanner Ⅲ 图像扫描系统（德国）观察并照相记录。

1.3 谱带统计及数据分析

记录易于辨认的多态性位点。扩增产物按同一迁移位置上条带在各个材料中的有（记为1）、无

（记为0）进行统计（不具多态性的条带不予统计），建立数据矩阵。SSR标记的变异的多样性指数 H’ ），是根据所有材料中等位基因出现的频率计算的（刘超，2012）：H =–ΣPi lnPi。其中，Pi （ ’

表示第i个等位基因出现的频率。利用NTSYS-pc 2.11软件，计算材料间的遗传相似性系数，根据

非加权算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建系统进化树。

Xδ形态学性状的数据分析参照尚建立等（2012）的方法，数量性状根据平均值（ ）和标准差（ ）

δ ，中间每级相差0.5δ分为10级，1级 < X –2 δ ，10级 ≥ X + 2 。各性状的遗传多样性采用Shannon’s

H’ ）进行评价： H ’=–ΣPi lnPi，Pi表示第i种变异类型出现频率，用所有相应的各个性 信息指数（

状 H ’的平均值表示一组或所有种质的遗传多样性程度。采用Excel计算各性状的最大值、最小值、 平均值、极差和变异系数，采用SPSS 20.0进行方差分析和显著性测验，采用NTSYS-pc 2.11软件

进行UPGMA聚类。

2 结果与分析

2.1 形态学性状遗传多样性分析

47份砧用南瓜种质资源质量性状分布及多样性情况见表2，多样性指数的变化范围为0.18 ~

1.45，平均值0.79。其中，多样性指数最高的质量性状为嫩瓜皮色，主要以浅绿色（频率31.91%）、 绿色（21.28%）、深绿色（19.15%）为主。共有8个质量性状的多样性指数大于1.00，包括嫩瓜皮

色、瓜形、主蔓色、瓜面斑纹、叶面白斑、叶形、嫩瓜斑纹、嫩瓜斑纹色。瓜形的多样性指数为1.44， 主要为扁圆形（19.79%）、近圆形（25.53%）和梨形（17.02%）。40.43%的种质的主蔓颜色为深绿色。 瓜面斑纹以块状为主，占所有种质的48.94%。50%以上种质（51.06%）没有叶面白斑。大部分种质