抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建及烟草的转化(2)

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ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ．Ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ

，ｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｔｈｅｗａｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ

ｕｓｅｏｆｔｈｅＣＭＶ２ＳＰ１／ＣＭＶ２ＡＳＰ２，ＣＭＶ２ＳＰ３／ＣＭＶ２ＡＳＰ４ｏｆｔｈｅｄｅｓｉｇｎｐｒｉｍｅｒｓＣＭＶＲＮＡ２，ａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅＤＮＡＭＡＮ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．２．２，Ｌｙｎｎｏｎ

）ｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｓｅｑｕｅｎｃｅＢｉｏｓｏｆｔ

［９］

ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＲＮＡｉｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｒｅｇｉｏｎｓｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｐｒｉｍ，ａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｐｒｅｓｅｒｖｅｄｏｎｔｈｅＴｖｅｃｔｏｒｗａｓｅｒｓｕｓｅｄａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ，ｔｈｅｔｗｏｐａｉｒｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓＣＲ２Ｋｐ／ＣＲ２ＳＢａｎｄＣＲ２Ｂｇ／ＣＲ２ＳＢｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．１１，Ｎｏ．５，２０１０

ａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｙｗａｓｏｆ７１．３％－９８．８％ａｎｄ７４．０％－９８．５％

（Ｔａｂｌｅ３），ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅｈａｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈＰｈｙｌｉｎｅｓｗｈｉｃｈｗａｓｆｒｏｍＺｈｅｊｉａｎｇｏｆＣｈｉｎａ，ｔｈｅＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒｗａｓＤＱ４１２７３１（Ｆｉｇ．２），ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎ

ｏ

ｆｒａｇｍｅｎｔＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫａｎｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ　ＡｆｔｅｒｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＢａｍＨⅠａｎｄＫｐｎⅠｄ

ｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄｐｉＲＤＧ１２ｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄ

，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２．Ｓｆｉｒｓｔｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ（Ｆｉｇ．１Ａ）．ＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｗａｓｒｅｃｏｖｅｒｅｄｗｉｔｈＢｇｌⅡａｎｄＳａｃⅠｄ

ｉｇｅｓｔｉｏｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｄｉｇｅｓｔｅｄｐｉＲＤ＿ＣＲ２．Ｓｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｓｅｒｔｅｄ

，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２ｓｅｃｏｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｇａｉｎｅｄ（Ｆｉｇ．１Ｂ）．ＡｆｔｅｒｔｈｅｐｉＲＤ＿ＣＲ２ｖｅｃｔｏｒｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＸｂａⅠａｎｄＥｃｏＲⅠ，ｔｈｅｓｍａｌｌｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｆｄｉｇｅｓｔｅｄｐＢｉ３５ＳＧ１２，ａｎｄｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｐＢｉ３５ＳＣＲ２

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ（

Ｆｉｇ．１Ｃ），ｔｈｅｄｅｓｉｇｎｏｆｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｄｗｉｔｈＶｅｃｔｏｒＮＴＩａｓｓｉｓｔ

．

Ｆｉｇ．１　ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｉＲＤＣＲ２．Ｓ（Ａ），ｐｉＲＤＣＲ２（Ｂ）ａｎｄ

ｐＢｉ３５ＳＣＲ２

（Ｃ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｏｔｏｂａｃｃｏ　Ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ

ｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＧＶ３１０１，ｔｈｅＮｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｔ）ｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｃｕｔｉｎｔｏ１ｃｍｏｆｌｅａｆｄｉｓｃ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｔｈｅｎｍｉｘｅｄｗｉｔｈＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎｌｉｑｕｉｄｆｏｒ５－１０ｍｉｎｏｆｓｏａｋｉｎｇ，ｔｈｅ

ｅｘｃｅｓｓｂａｃｔｅｒｉａｌｉｑｕｉｄｗａｓｒｅｍｏｖｅｄａｎｄｄｒｉｅｄ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｙｗｅｒｅｐｌａｃｅｄｏｎｔｈｅｃｏｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ（

ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｏｆ６ＢＡ），ａｆｔｅｒｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎｄａｒｋｆｏｒ１－３ｄ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｔｒａｎｓ

ｆｅｒｒｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ（

ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌｏｆ６ＢＡ＋５０．０ｍｇ／Ｌｏｆ

Ｋａｎ＋３００．０ｍｇ／ＬｏｆＣａｒ）ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄ．Ｗｈｅｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｓｈｏｏｔｌｅｎｇｔｈｗａｓａｂｏｕｔ１．５－２．０ｃｍ，ｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｈｏｏｔｗａｓｃｕｔｏｆｆａｎｄ

ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｔｏｒｏｏｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ（

ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬｏｆＩＡＡ＋５０．０ｍｇ／ＬｏｆＫａｎ＋３００．０ｍｇ／ＬｏｆＣａｒ）ｆｏｒｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｏｏｔｓ．

ＲｅｓｕｌｔｓａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ

ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｅ

ＰｒｉｍｅｒｓＣＭＶ２ＳＰ１／ＣＭＶ２ＡＳＰ２，ＣＭＶ２ＳＰ３／ＣＭＶ２ＡＳＰ４

ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ１５５３ａｎｄ１３７８ｂｐ

，ａｆｔｅｒｔｈｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｓａｎｄｓｐｌｉｃｉｎｇ，ｐａｒｔｓｏｆＣＭＶＲＮＡ２ｇｅｎｏｍｉｃｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ２８６４ｂｐｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄｔｈｅｓｅｐａｒｔｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｅｎｃｏｄｅＣＭＶ２ａ

ｒｅｐｌｉｃａｓｅｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＣＭＶ２ｂｐｒｏｔｅｉｎ

，ｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆＤＮＡＭＡＮｓｏｆｔｗａｒｅ，ｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＣＭＶ２ａｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆＮＳ０４ｉｓｏｌａｔｅａｎｄｏｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｓ（ＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒａｎｄｏｒｉｇｉｎｗｅｒｅｓｈｏｗｎｉｎＴａｂｌｅ２）ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏ

Ｆｉｇ．２　ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＣＭＶ

２ａｉｓｏｌａｔｅｓ

ａｃｉｄｈｏｍｏｌｏｇｙｗｅｒｅ９８．０％ａｎｄ９６．５％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｔａｂｌｅ２　ＴｈｅＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔＣＭＶｉｓｏｌａｔｉｏｎｓＧｅｎｂａｎｋｎｕｍｂｅｒＯｒｉｇｉｎ

ＩｓｏｌａｔｉｏｎｓＡＢ３６８５００ＪａｐａｎＣＭＶＰｆＡＢ０７９８９０ＪａｐａｎＣＭＶ３６ａ１ＡＢ１７９７６５ＪａｐａｎＣＭＶＤ８ＡＢ３６８４９７ＪａｐａｎＣＭＶ４２ＣＭＤＱ３９９５４９ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＢＸＤＱ４１２７３１ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＰｈｙＥＦ２１３０２４ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＣＴＬＡＭ１８３１１５ＳｐａｉｎＣＭＶＰｌ１ＡＢ１８３１１８ＳｐａｉｎＣＭＶＲｉ８ＥＦ２０２５９６ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＴｓｈＤ１０２０９ＪａｐａｎＣＭＶＯＤ８６３３０ＢｅｉｊｉｎｇｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＳＤＥＵ６６５００１ＢｅｉｊｉｎｇｏｆＣｈｉｎａＵｎｋｎｏｗｎＳ７２１８７ＵｎｋｎｏｗｎＣＭＶＫＥＵ７２３５７０ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＰＨｚＦＪ２６８７４５ＺｈｅｊｉａｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｈｉｎａＣＭＶＣａｈ１ＡＪ２７６４８０

Ｋｏｒｅａ

ＣＭＶＭｆ

ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｓ

ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｎｅｃｔｅｄｔｏｔｈｅＴｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒａｎｄｈａｄｃｏｒｒｅｃｔａｌｉｇｎｍｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅＮＣＢＩｄａｔａｂａｓｅｄａｔａｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｔｅｍｐｌａｔｅ．Ｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆｔｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｐｒｉｍｅｒｓ

ＣＲ２Ｋｐ／ＣＲ２ＳＢａｎｄＣＲ２Ｂｇ／ＣＲ２ＳＢ

，ｔｈｅＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＢＫｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ６９３ｂｐａｎｄＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｆｒａｇｍｅｎｔｗｉｔｈ７４１ｂｐｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ（Ｆｉｇ．３，４）．ＴｈｅｔｗｏｅｎｄｓｏｆｔｈｅＰＣＲ＿ＣＲ２

ＢＫｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｗｏｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓｏｆＢａｍＨⅠａｎｄＫｐｎⅠ

，ｗｈｉｌｅＢｇｌⅡａｎｄＳａｃⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｔｏｔｈｅｔｗｏｅｎｄｓｏｆＰＣＲ＿ＣＲ２＿ＳＢｔｏｆａｃｉｌｉｔａｔｅｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｆｏｌｌｏｗｕｐｖｅｃｔｏｒ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＢｉ３５ＳＣＲ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ

ＡｆｔｅｒｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｏｆＰＣＲＣＲ２ＢＫａｎｄｐｉＲＤＧ１２，ａ

４７６３ｂｐｏｆｐｉＲＤＣＲ２．Ｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ

，ｔｈｅｒｅｗａｓａＣｌａＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓｉｔｅｉｎｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｅｄＰＣＲＣＲ２ＢＫｆｒａｇ

ｍｅｎｔ，ａｎｄａ４７６３ｂｐｂａｎｄｗａｓｇａｉｎｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔＰＣＲＣＲ２ＢＫｈａｄｃｏｎｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｖｅｃｔｏｒ（Ｆｉｇ．５）．ＡｆｔｅｒｔｈｅｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｏｆＰＣＲＣＲ２ＳＢｆｒａｇｍｅｎｔｓａｎｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｖｅｃｔｏｒｐｉＲＤＣＲ２．Ｓ，ｐｉＲＤＣＲ２ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ，ｆｉｎａｌｌｙ