一个控制水稻叶色白化转绿及多分蘖矮杆性状基(3)

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第１期郭涛等：一个控制水稻叶色白化转绿及多分蘖矮杆性状基因ｈｗ－ｌ（ｔｆｆｌ９鉴定

幼苗取等量新鲜叶片，加液氮研磨，按１０ｍＬ

ｇ－１加

入预冷（一２０。Ｃ）酒精／水混合液（５／１，ｖ／ｖ），＿４℃过夜萃取。８０００ｘｇ离心１５ｍｉｎ使固液相分离，重新萃取不溶性残渣１２ｈ。将２次萃取的上清液混合，真空旋转干燥至第二相。加入等体积石油醚，过滤１５

ｍｉｎ

除去油脂和部分植物色素；重复抽提两次，弃石油醚相。用等体积的乙酸乙酯萃取水相２次，弃水相，真空干燥有机相。残留物溶于５

ｍＬ

１００％蚁酸，以

多微孔膜（Ｏ．４５ｕｍ）过滤。每个样本取２０ｕＬ注入ＨＰＬＣ仪（ＬＣ．２０ＡＴ，Ｓｈｉｍａｄｚｕ，日本），流速１

ｍＬ

ｍｉｎ～，以ＵＶ检测探头在波长２５４ａｍ下连续监控

２０

ｍｉｎ。流动相由甲醇，水，乙酸（４５／５４．４／０．６，ｖ／ｖ／ｖ）

组成。分别将ＩＡＡ和ＧＡ３溶于甲醇／水（４／１，ｖ／ｖ）配成标准液（２ｍｇ

ｍＬ＿１），并稀释成５个不同数量级浓

度。

１．５突变体对温度的敏感性

采用相同光强度、光周期和不同温度（１５。Ｃ、２０℃、２５℃、３０℃、３５＂Ｃ）在人工气候箱（ＲＸＺ．２８０Ｂ，江南，中国）中培养突变体和亲本，观察第１～４叶片颜色变化。

１．６净光合率和叶绿素含量测定

在ＬＥＤ光源下采用便携式光合测定仪（Ｌｉ．６４００，Ｌｉｎｃｏｌｎ，美国）于苗期和拔节期测定突变体和亲本

上二叶的净光合率，检测时间为上午８：３０—１０：００。其后分别从每个处理取３株材料的新鲜叶片，等量混

合（０．１～０．５ｇ），用９５％丙酮抽提４８ｈ。采用分光光度

计分别测定抽提液在波长６４５ｎｍ和６６３ａｍ下的ＯＤ

值。利用ＡＩＴＩＯｎ掣６１１的方法计算总叶绿素、叶绿素

ａ和叶绿素ｂ的含量，每个处理重复３次。

１．７叶绿体超微结构观察

将水稻幼苗不同时期的叶片切成小块（３

ｍｌｎ

ｘ

１

ｍｍ），用４％戊二醛溶液固定（含０．１ｍｏｌＬ＿１ｐＨ７．３

磷酸缓冲液和ｌ％锇酸）。再以不同浓度乙醇溶液脱

水，环氧树脂８１２包埋，超微切片机（ＵＣＴ，Ｌｅｉｃａ，德

国）切片，电子显微镜（Ｔｅｃｎａｉｌ２，ＦＥＩ，荷兰）下观察叶绿体超微结构并照相。

１．８

ＤＮＡ提取及ＰＣＲ检测

采用ＣＴＡＢ法【３２】提取水稻基因组ＤＮＡ。ＰＣＲ

扩增体系含２ｘＰＣＲ

Ｒｅａｃｔｉｏｎ

Ｍｉｘ１０ｐＬ（含１００

ｍｍｏｌＬ～ＫＣｌ、２０ｍｍｏｌ

Ｌ－１

Ｔｒｉｓ—ＨＣｌ、３ｍｍｏｌＬ一１

ＭｇＣｌ２、４００ｍｍｏｌＬ～ｄＮＴＰ），ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５

Ｕ

“Ｌ－１）０．２ｐＬ，引物（１０ｐｍｏｌＬ＿１）各１ｐＬ，模板ＤＮＡ

Ｉ

ｕＬ，超纯水补至２０¨Ｌ。反应条件为９４。Ｃ预变性

５

ｍｉｎ；９４＊Ｃ变性３０Ｓ，５５＊Ｃ退火３０Ｓ，７２＊Ｃ延伸３０

Ｓ，

３５个循环；７２＊Ｃ延伸７ｍｉｎ。扩增产物经８．０％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（电泳缓冲液ｌｘＴＢＥ，电压７５Ｖ时间２．５ｈ），０．１％ＡｇＮ０３染色，ＢＩＯＲＡＤ凝胶成像系统观察、照相、读带。

１．９

ＳＳＲ标记来源及ｌｎＤｅｌ标记的开发

选择已公布的ＳＳＲ标记用于突变基因定位，引

物序列来自ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／。

按照Ｓｈｅｎ等［３３】的方法，在ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．布的核苷酸序列进行ＢＬＡＳＴ对比，在已定位区间内‘寻找插入缺失５。２０ｂｐ的序列，根据其上下游序列１．１０连锁分析

采用Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅ等【３４】提出的近等基因池分析法筛选突变基因连锁标记。在Ｆ２群体中随机挑选１０因池间扩增有差异的标记，再用分离后代单株验证找与突变基因紧密连锁标记在水稻基因组（日本晴）

ｈｆａ．１叶色受生长发育和温度调控

三叶期之前，突变体ｈｆａ．Ｊ的第１和第２片叶为

白色，随后逐渐转绿（图１．Ａ—Ｄ），三叶期之后，叶片由叶基到顶端，叶脉至叶缘完全转绿，有时新分蘖叶片也为白色，但很快转绿。相反，突变体亲本而ｈｆａ．．ｆ的白化转绿表型则受温度调控（图１一Ｅ～Ｈ），当温度为２５—３０＊Ｃ时，叶片完全白化，温度介于

１５—２０＊Ｃ时，叶片为黄白色。显然，ｈｆａ．Ｊ的叶片颜色

同时受植株的生长发育和外界的温度调控。

叶绿素缺失导致ｎｙａ．１叶片白化

为进一步研究突变体的白化转绿表型，分别于

和亲本叶片的叶绿素含量和净光合速率（表１）。结果

ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）上对粳稻日本晴和籼稻９３．１１已公设计ＩｎＤｅｌ标记引物。

个突变表型植株和１０个正常表型植株，分别取等量ＤＮＡ混合，构建两个基因池。通过引物筛选寻找基该多态性标记是否真正与目标基因连锁。利用ＭＡＰＭＡＫＥＲ作图软件构建目标基因区域的连锁图谱。通过Ｇｒａｍｅｎｅ网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／）查上的位置，构建覆盖目的基因的物理图谱。用禾本

科基因组自动注释系统（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ／）预测候选区域的基因组序列可能的编码区（ＯＲＦ）。

２结果与分析

２．１

Ｆｒａｎｃｉｓ叶片在不同生长发育时期均为绿色。人工控温条件下，突变体亲本Ｆｒａｎｃｉｓ叶色未受温度影响，２．２

水稻二叶期（白化期）和拔节期（转绿期）测定突变体