蛋白样本制备与Western Blot

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主要内容

1 2 3 4 5 6

蛋白样本制备的目的

蛋白样本制备总体原则和策略

案例分析— 案例分析—细胞总蛋白的提取

蛋白提取产品选择指南

蛋白定量方法的选择

成功的 Western Blot

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一

蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础 蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础 --蛋白样本制备的目的: 蛋白样本制备的目的 后续应用

activity assays

ELISA

protein microarrays

蛋 白 样 本

EMSA

SDS-PAGE /IEF

2-DE

immunoblotting

mass spectrometry

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二

蛋白样本制备的原则

方法应具备标准化， 可靠性、简便性； 方法应具备标准化，具有重现性 、可靠性、简便性； 尽量抽提完全； 尽量抽提完全；

蛋白 样本 制备 原则

应使所有蛋白全部处于溶解状态 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、 防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性 防止在抽提过程中发生化学修饰 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 如做 则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

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二

蛋白样本制备的策略

实验材料 细胞 组织 固定组 织或石蜡包埋组织 微 生物 酵母 植物 提取 RNA后的剩余的蛋白 样本等

制备蛋白的目的 活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀 1D 2D EMSA CHIP等

方法的选择 1 自行配制抽提试剂, 根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒, 按其说明书的方法提取

目的蛋白的结性质 与分布 分布于胞桨/胞核/ 膜 可溶/不可溶 含 量多少 分子量大小 四级结构特征 磷酸 化等修饰……

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案例分析-三 案例分析 细胞中总蛋白的制备

裂解样品

离心收集

定量检测

细胞加入裂解 液冰上放置 10-15分钟 10-15分钟

高速离心收集 上清即得全蛋 白样本

蛋白定量和 SDSSDS-PAGE 检测

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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点

缓冲液

表面活性剂

其它： 其它：H2O、NaCl、等 、 、

RIPA Buffer

蛋白酶抑制剂

还原剂 磷酸酶抑制剂

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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点

Tris-HCl（pH7.5),提供 环境，使蛋白保持稳定， （ 提供pH环境 提供 环境，使蛋白保持稳定， 增加溶解性。 增加溶解性。

缓冲液

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细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点

表面活 性剂

溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白） 分为离子型（ 分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（ 、脱氧胆酸盐等）和非离子型（ 系列等）。 如NP-40、Triton-100、tween系列等）。 、

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