siRNA非病毒递送载体的研究现状(3)

siRNA 非病毒 递送载体 现状

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药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2011, 46 (12): 1436 1443

3.2.1.2 表面电荷 带正电的纳米粒容易与带负中带有大量的仲胺基团和叔胺基团。在生理条件下, PEI中有1/6～1/5的氮原子是质子化的, 具有“质子海绵效应”、高的电荷密度和较强的缓冲能力, 能够保护核酸免受核酸酶的降解, 并能辅助核酸从内涵体中释放。但是PEI分子表面较高的正电荷密度会 导致严重的细胞毒性, 成为限制PEI应用的重要影 响因素。用其他聚合物包裹低分子量的PEI, 可以改进其性质, 如: 增加靶向性、延长血液循环时间、增加血清稳定性和生物相容性等[23, 24]。通过对PEI进行结构修饰以降低毒性并保持基因递送效率是近年来的研究热点。PEI及其衍生物在siRNA递送方面 实验结果表明, 修饰后的已有比较广泛的研究[25, 26]。

产物mPEG-PCL-g-PEI转染效率提高, 细胞毒性降低, 是较理想的递送载体; 给皮下肿瘤模型的小鼠腹腔注射PEI-siRNA复合物后, 肿瘤生长速度显著减慢。其机制可能是通过下调siRNA介导的HER2 (human epidermal growth factor 2); 另外, PEG修饰的PEI- siRNA纳米粒已经成功用于体内外实验[27]。该复合物靶向胃癌细胞的CD44v6受体, 经PEG修饰后纳 米粒的细胞毒性减小, 溶解性和体内稳定性增加; 与血清蛋白的非特异性结合减少, 保持较高的转染效率[28]; 雄性C57BL小鼠静脉注射3 μg PEI-PEG siRNA复合物后无死亡现象, 也未见其他急性毒性, 复合物的半衰期大于30 min, 而PEI/siRNA复合物的半衰期仅为13 min[29]。向基于PEI分子的载体中引入疏水基团也是减小细胞毒性的方法, 然而表面电荷密度要适度减小, 保证PEI表面有足够的正电荷发挥“质子海绵效应”。Oskuee等[30]向支链PEI (25 kDa) 中引入不同取代度的羧酸烷基疏水基团, 以增加其疏水性并中和部分正电荷。结果表明低羧酸化度 (<20%)

电的细胞膜结合从而被细胞摄取。体内带负电大分子如血清蛋白、白蛋白等在生理盐浓度条件下, 纳米粒间的互相排斥可能会发生聚集。对于非特异性细胞吞噬的摄取方式, 小于150 nm是可以接受的粒径范围。此类粒子过度聚集完全不能实现细胞内化。 3.2.1.3 低毒性[6] 病毒载体是最早研究的siRNA载体, 但是会通过激活免疫反应而诱发毒性。因此开发了合成的脂质体和聚合物来替代病毒载体进行核酸递药, 并且对其进行了精细的设计以避免激活免疫系统。大分子材料要求其有生物可降解性, 以降低毒性。

3.2.2 阳离子脂质及脂质类似物

脂质体用于核酸递送已经有20多年, 最初是由Felgner等[12, 13]用阳离子脂质DOTMA递送DNA和RNA到大鼠、小鼠和人细胞系。现代技术可以通过凝胶电泳及荧光光度法等测定siRNA脂质体的含量和包封率, 其研究已经由定性发展到定量阶段[14]。

Morrissey等[15]证明了一种靶向HBV RNA的siRNA—SNALP复合物可以抑制HBV复制, 连续每天注射3 mg·kg 1能够将血清HBV水平抑制至原来 剂量依赖性, 定的1/10, 并且该抑制效果具有特异性、

量给药后药效至少可以持续7天。Zimmermann等[16]证实了SNALPs可以敲除短尾猴肝脏中的ApoB, 单次注射siRNA 48 h后, ApoB mRNA的沉默效果具有剂量依赖性, 沉默效果大于90%。在最大给药剂量 2.5 mg·kg 1时效果可以持续11天。Sato等[17]研究发现, 将维生素A偶联的Lipotrust脂质体递送抗-gp46的siRNA至纤维化的肝细胞治疗肝硬化。据报道5组siRNA复合物给药组可以解决大鼠肝纤维化并且能延长有严重肝纤维化大鼠的存活期, 具有剂量和持续时间依赖性。同时证明了治疗效果与脱靶效应无关, 也与固有免疫系统的募集反应无关。

尽管如此, 脂质体给药系统上存在缺乏靶向性、转染率低和全身给药的毒性等问题。其毒性和siRNA脱靶效应等问题, 限制了它在体内的应用。 3.2.3 聚合物

聚合物递送系统可以保护siRNA免受核酸酶的降解, 并且与配体结合后可以实现siRNA靶向递送。然而, 转染效率低是合成纳米载体存在的最大问题。线型或树枝状的阳离子聚合物能有效地结合siRNA形成稳定的纳米粒, 可以作为有效的转染材料。

聚乙烯亚胺 (polyethyleneimine, PEI) 是研究最广泛用于系列核酸的递送载体[18 22], PEI分子结构

时, 复合物从内涵体逃逸的效果最好。另有研究显示, 随着烷基取代基链长的增加, 其与siRNA形成的复合物稳定性增加[31]。对于不同分子量的交联PEI, 低分子量的PEI毒性较小, 同时其转染效率也低于高分子量的PEI。在选择应用交联PEI时, 要综合考虑毒性和转染效率的问题[32 34], 研究发现基因转染效率随着偶联的分支状PEI数量的增加而增加, 即转染效率: 线型PEI (lPEI) <二硫键耦合的线型PEI (ssPEI) <

分支状PEI (bPEI)[35]。

壳聚糖 (chitosan, CS) 是另一种研究较多的基因递送载体[36]。CS是甲壳胺 (chitin) 脱乙酰基的产物。甲壳胺是从虾皮、蟹壳等提取出来的天然高分子多糖, 由N-乙酰-氨基葡萄糖以β-1, 4苷键结合而成, 分子质量在100～200万之间。热的浓碱溶液与甲壳