抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究(2)

抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究

5期 孙 健等：抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究 973

前已发现的ALS抑制剂抗性杂草中，共有6个ALS基因位点发生了突变，从而导致ALS发生变异。这些位点在拟南芥ALS氨基酸序列中相应的位置及表达的氨基酸分别为第122位丙氨酸（Ala122），第197位脯氨酸（Pro197），第205位丙氨酸（Ala205），第376位天冬氨酸（Asp376），第574位色氨酸（Trp574）和第653位丝氨酸（Ser653）[6,9-11]。其中，有5个位点分别位于Domain C、Domain A、Domain D、Domain B和Domain E 5个保守区中，第376位天冬氨酸被谷氨酸取代是近期发现的一个新的突变位点。目前，报道最多的是Domain A的Pro197位点的突变。

中国正式报道的有3种，分别是雨久花（Monochoria korsakowii）对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆[12]、慈姑（Sagittaria montevidensis）对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆[13]及播娘蒿（Descurainia sophia）对苯磺隆[14-15]产生抗药性。【本研究切入点】目前冬小麦田猪殃殃发生严重，部分地区农业技术员反映使用苯磺隆常规剂量已无法有效控制其发生危害。唐贵章等[16]发现，苯磺隆防除麦田猪殃殃不论冬季前施药还是春季施药，效果均不理想，但目前未见从分子水平研究猪殃殃对苯磺隆的抗性机制。【拟解决的关键问题】本研究从分子水平研究猪殃殃对苯磺隆的抗性机制，并初步明确其产生抗药性突变的基因位点。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试抗药性猪殃殃种子分别于2007年和2008年5月采自山东省济宁市梁山约有10年苯磺隆使用历史 的冬小麦田，室内盆栽经75%苯磺隆水分散粒剂 54 g a.i./hm2处理仍存活，并继续培养，单株收集存活猪殃殃种子，供测试用。

供试敏感型猪殃殃种子采自同一地区的非农田（从未使用过除草剂），室内盆栽经75%苯磺隆水分散粒剂18 g a.i./hm2处理，16 d后全部死亡。 1.2 试验方法 1.2.1 温室盆栽法

[17]

每盆面积100 cm2

，对单株收

集的猪殃殃种子进行催芽，播种露白的种子，每盆10粒，置于温室内培养。温室温度白天（25±5）℃，夜间为（15±5）℃，光照强度为15 000—23 500 lx，相对湿度（75±5）%。待叶片长至3—4轮，取幼嫩叶片（0.2 g/包），经消毒处理后，放入-80℃冰箱内保存，备用。

1.2.2 引物的设计与合成 目前已有多种植物的

ALS基因被克隆和报道，从NCBI的GenBank登记的ALS基因序列中，选取拟南芥等5种植物的ALS氨基酸序列，找出这几种植物共有的同源保守区（表1），参考其保守区域设计引物，引物由上海博尚生物技术有限公司合成。

表1 不同植物的ALS基因序列

Table 1 ALS gene sequence identification from various plant

species

登录号* 生物 碱基数

氨基酸数

Accession Organism

NucleotideAmino acid

No. AY541454向日葵（Helianthus annuus L.） 1959 652 U16279 苍耳（Xanthium strumarium L.） 1947

649

X07644 烟草（Nicotiana tabacum L.） 2004 667

X16708 油菜（B.napus L.） 1896 637 X51514

拟南芥（Arabidopsis thaliana L.） 2013

670

* 在NCBI GenBank上的登记号 NCBI GenBank accession number

根据上述植物的ALS序列保守区设计了2对引物（表2），这2对引物扩增的片段长度约为520 bp（没有内含子的情况下），包含已报道的一个保守区。用温度梯度PCR仪（Biometra T-Gradient Thermoblock）确定每一对引物的最佳退火温度。

表2 扩增猪殃殃ALS片段的引物

Table 2 Primers designed for Galium aparine ALS gene amplification

引物 序列

退火温度 Primer

Sequence（5′-3′）

Annealing temperature (℃)

Ⅰ-F TTGGGAAGAAYAARCARCC 53

Ⅰ-R TTYCCBARGTAKGTATGWGCC Ⅱ-F GGAAGAATAARCARCCTCATG 55 Ⅱ-R YTCCCAYTGAACMACCATAC

Y=C或T；R=A或G；B=C或G或T；K=G或T；W=A或T；M=A或C

Y=C/T; R=A/G; B=C/G/T; K=G/T; W=A/T; M=A/C

1.2.3 反转录（RT） 用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit试剂盒提取猪殃殃叶片的总RNA。cDNA第一链的合成用TIANGEN公司的Quantscript RT Kit来完成。在20 µL的反应体系中包括：3 µL的总RNA，2 µL的10×RT Mix，2 µL的 dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each），2 µL的Oligo-dT15（10 µmol·L-1），1 µL的Quant Reverse Transcriptase，