抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究(3)

抗苯磺隆猪殃殃乙酰乳酸合成酶的突变研究

974 中 国 农 业 科 学 43卷

10 µL的RNase-free水。反转录条件按照试剂盒说明，反转录产物立即作为模板进行PCR扩增。

1.2.4 ALS基因片段的克隆 全部PCR均使用TIANGEN公司的试剂盒Taq DNA Polymerase完成。第一轮PCR的50 µL的反应体系含：37 µL的ddH2O，5 µL的10×Taq Buffer，1 µL的dNTP Mixture（10 mmol·L-1），1.5 µL的PrimerⅠ-F（10 µmol·L-1），1.5 µL的PrimerⅠ-R（10 µmol·L-1），1 µL Taq DNA Polymerase（2.5 U·µL-1），3 µL的反转录产物为模板。第二轮PCR将引物改为PrimerⅡ-F和PrimerⅡ-R，将模板改为2 µL的第一轮PCR产物，其它成分与第一轮PCR的相同。第一轮PCR反应条件设定为：94℃预变性4 min，然后，94℃变性40 s，53℃退火40 s，72℃延伸3 min，共20个循环。最后72℃延伸10 min；第二轮PCR反应条件设定为：94℃预变性4 min，然后，94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸3 min，共30个循环。最后72℃延伸10 min。扩增产物于琼脂糖凝胶中电泳检测。将扩增产物进行回收，连接到pMD18-T载体，然后转到大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有Ampicilin和X-gal/IPTG的LB固体培养基上培养过夜，挑取白色菌落到含Ampicilin的LB培养液中震荡培养，取菌液为模板进行PCR鉴定，得到的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证。 1.2.5 生物信息学分析 将测序的序列进行BLASTx比对，得到蛋白序列，然后用DNAman软件对扩增出的抗药性和敏感型猪殃殃ALS基因的蛋白序列进行比对。

2 结果

2.1 猪殃殃总RNA检测结果

在常规琼脂糖凝胶电泳中，较好的RNA产物应该可以看到2条明显的优势rRNA条带，分别为28S rRNA、18S rRNA，条带亮度比值约为2:1。图1是猪殃殃总RNA的常规琼脂糖凝胶电泳检测结果，发现RNA略有降解，18S rRNA的亮度高于28S rRNA，但不影响下一步试验。

2.2 猪殃殃ALS基因片段的克隆

以猪殃殃的cDNA为模板，按上述PCR反应条件进行扩增，得到一条大小约为500 bp的基因片段（图2），与预期目的片段520 bp的大小一致。将目的片段进行克隆、测序。

2.3 猪殃殃ALS基因片段的菌落PCR鉴定

将转化后的单克隆菌落于含Ampicilin 的LB液

图1 猪殃殃总RNA电泳检测

Fig. 1 The total RNA of Galium aparine

M：DNA marker D2000；R：抗性猪殃殃；S：敏感猪殃殃

M: DNA marker D2000; R: Resistant Galium aparine biotype; S: Susceptible Galium aparine biotype

图2 抗药性、敏感生物型猪殃殃ALS基因的扩增

Fig. 2 Amplification of ALS fragments from resistant and

susceptible Galium aparine biotype

体培养液中震荡培养，以菌液为模板进行PCR鉴定，2种生物型均扩增出目的片段（图3）。 2.4 猪殃殃ALS基因片段的生物信息学分析

与敏感生物型相比，抗性生物型猪殃殃ALS编码区共有3个氨基酸残基发生突变（表3），即第457位苏氨酸突变为丝氨酸，第573位谷氨酰胺突变为丝氨酸，第574位色氨酸突变为甘氨酸。其中，只有第574位氨基酸的突变位于高度保守区Domain B处，第457位、573位氨基酸突变位于非保守区。