细胞实验步骤(3)

当细胞状态不好时，培养液有混浊感，不变黄，可再观察两天，若还没有明显的变化，就丢弃。镜下（细胞大小形态，透光度，细胞膜，细胞浆，抱团现象）观察：细胞悬浮，透亮，细胞大小基本均一，也有“大个子”的细胞（细胞膜完整，不是细胞肿胀，而是处于分裂前期的细胞），或葡萄串状的，形态规则，呈圆形，细胞膜完整，胞浆清澈。细胞密度较低时，可以见到一簇一簇的细胞群，呈葡萄串状生长，此时可放到培养箱继续培养1-2天再传代。当细胞密度较高时，细胞呈单个生长，在培养液中细胞层层排列，微调显微镜，可明显看到细胞分布在培养液的每一层，此时细胞须进行传代，否则细胞密度高了会影响细胞的状态。

（2）细胞传代：当培养瓶中细胞培养液<10ml时，可直接向培养瓶中加入新鲜培养基，然后继续放入培养箱中培养。若培养瓶中细胞培养液接近10ml，用玻璃吸管吹打混匀细胞，转入10ml离心管中，1000r/min，5min，可看到细胞团块，弃上清，加入3-4ml新鲜完全培养液（RPMI1640+10%胎牛血清），吹打混匀细胞，按1：2—1：4比例传代。

细胞冻存（缓慢冷冻）：（1）一定要选生长状态好（形态规则，透亮的细胞）的细胞，若细胞密度不高，则3瓶冻一管；若细胞密度较高，则2瓶细胞冻一管。

（2）在冻存前一天最好换一次培养液。

（3）用玻璃吸管吹打混匀细胞，收集于10ml离心管中，离心1000r/min，5min。

（4）配制冻存培养液：按冻存的管数配制相应量的冻存液。若是

两个培养瓶的细胞冻一管，则在一个新的离心管中配制400ul胎牛血清+100ulDMSO，混匀，备用。

（5）细胞离心后，弃去上清（尽量将上清液弃尽），加入500ul的

胎牛血清，混匀细胞，转入另外一个有细胞团块的离心管中，混匀。

（6）将配置好的冻存培养液缓慢加入细胞悬液中，吹打混匀，转

入2ml的冻存管中。（这样的冻存步骤主要是为了减少DMSO散热对细胞产生的影响）冻存管的盖子一定要旋紧。

（8）冻存管上写明细胞的名称，冻存时间，冻存人的姓名，冻存

的管数号。用封口膜将瓶口封住。

（7）细胞冻存程序降温：将标记好的冻存管放入4℃，30min——

-20℃，50-60min——-80℃。（从-20℃取出来转入-80℃之前，需用棉花包住冻存管，减少外界温度对细胞的影响）

（8）在实验记录本上记录冻存记录，包括冻存时间，冻存时细胞

状态，多少培养瓶的细胞合并冻于一个冻存管，做的什么标记，冻存的管数，在-80℃冰箱中存放处。

（9）注意：细胞状态不好时（长的太过，培养液已经很黄；细胞