细胞实验步骤(4)

可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过两个月，细胞性状可能会改变）最好不要冻细胞；冻存的最佳时期：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内）

细胞复苏（快速融化）：（1）找到需要复苏的细胞在-80℃冰箱的位置，以便取细胞。

（2）水浴箱设定温度37-39℃。

（3）在超净台内事先准备好9mlRPMI1640于10ml离心管中备用稀释解冻的细胞悬液。

（4）从-80℃的超低温冰箱中取出冻存管，检查瓶盖

的松紧，并将其旋紧，立即放入准备的盛有37-39℃温水的小烧杯中，再转入水浴箱中轻轻晃动使其在1分钟内完全溶解（动作幅度不要太大，否则溶液将水浴箱中的水溅到冻存管口，容易引起污染。）用75%的酒精擦拭冻存管外部及管口，移入无菌操作台内。

（5）冻存管口在酒精灯上过火后，用吸管吸出细胞线

业，并缓缓注入事先准备的9mlRPMI1640中，混匀。离心，1000r/min，5min。弃上清，加入3-4ml RPMI1640+20%胎牛血清，混匀，按1：2或1：3转入培养瓶内，再注入一定量的新鲜RPMI1640+20%胎牛血清。

（6）镜下观察细胞，记录细胞状态及密度，放入培养

箱中培养。2天后换液或传代。这次仍然用20%的胎牛血清培养。在这之后可换成10%的胎牛血清培养。

（7）只要冻存工作完成的好，复苏大多没有困难，但是要有耐心。