实验九__总RNA的提取(3)

总RNA的提

（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度

1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。

2. 取RNA样品5μl，用水稀释50~100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。

3. 在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1 OD单位的单链RNA = 40μg/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。

4. 若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。

注意事项：

1. 从少量样品（1-10mg组织或10-10细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加1ml Trizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10 g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后加氯仿之前样品可在-60～-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5--20℃一年以上。

3. 预期产量：1mg组织或1×10细胞提取RNA分别为：

肝和脾6-10 g，肾3-4 g，骨骼肌和脑组织1-1.5 g，胎盘1-4 g，上皮细胞8-15 g，成纤维细胞5-7 g。

4. 蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml Trizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L NaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

5. 预防RNase污染措施：

1)

2)

3) 经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含624RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/L NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

4)

RNA的提取常见问题分析

问 题

得率低

A260/A280<

1.65 解 析 配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。 A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．RNA沉淀未完全溶解 A．检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中