实验九__总RNA的提取(5)

总RNA的提

3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

仪器和主要试剂：

1. 基因扩增仪(如PE GeneAmp PCR System 2400 或 9700)、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管

2．RNA提取试剂

3．第一链cDNA合成试剂盒

4．dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L

5．Taq DNA聚合酶

实验方法：

1. 总RNA的提取：见前述内容。

2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒为例。

（1）在0.2ml微量离心管中，加入以下：

总RNA 1-5 g

dNTP 1 l

Random primer 1 l

补充适量的DEPC H2O使总体积达10 l。轻轻混匀、离心。

（2）PCR仪上65℃加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

（3）然后加入下列试剂的混合物：

5×PrimeScript buffer 4 μl

RNase inhibator 0.5 μl

RTase 1 μl

RNase free H2O 4.5 μl

轻轻混匀，离心.

（4） 30℃孵育10 min。

（5） 42℃孵育60 min。

（6）于70℃加热15 min以终止反应，将管插入冰中。

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：

第一链cDNA 2 μl

上游引物（10pmol/L） 2 μl

下游引物（10pmol/L） 2 μl

dNTP(2mmol/L) 4 μl

10×PCR buffer 5 μl