核酸的分离与纯化_百替生物(10)

从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该法能很好回收小于1kb的单链或者双链DNA，且纯度很高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。如果将切下的聚丙烯酰胺凝胶块包埋于琼脂糖凝胶中，再进行DEAE纤维素膜插片法电泳或透析袋电泳洗脱，可以缩短双链DNA的回收时间。

三、基因组DNA分离纯化的方法学评价与质量保证

有关基因组DNA分离纯化的方法很多，每一种方法下又可衍生出许多具体的实验方案。对每一个具体的实验方案，大体上我们可以从方法的可行性与可靠性两个方面来加以考察。可行性方面包括方法是否简便、快速、安全及成本如何。可靠性则包括了方法的稳定性、重复性、特异性、产出比、最大产量及最小样品用量等。另一方面，由于酚具有高度的腐蚀性，需要采取特别的安全防护措施。

第三节 质粒DNA的提取与纯化

大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCC plasmid）DNA，简称闭环质粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。

一、提取与纯化的方法

质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml～2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml～50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。