核酸的分离与纯化_百替生物(7)

性、解聚，所以SDS同时还有降解DNA酶的作用；无DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；蛋白酶K则有水解蛋白质的作用，可以消化DNA酶、DNA上的蛋白质，也有裂解细胞的作用；酚可以使蛋白质变性沉淀，也抑制DNA酶的活性；pH8.0的Tris溶液能保证抽提后DNA进入水相，而避免滞留于蛋白质层。

多次抽提可提高DNA的纯度。一般在第三次抽提后，移出含DNA的水相，作透析或沉淀处理。透析处理能减少对DNA的剪切效应，因此可以得到200kb的高分子量DNA。沉淀处理常以醋酸铵为盐类，用2倍体积的无水乙醇沉淀，并用70%的乙醇洗涤，最后得到的DNA大小在100kb～150kb。

运用该法可以从单层或悬浮培养细胞、新鲜组织及血液标本中制备少于10mg至大到数百mg的DNA样品。由于分离纯化的每一步都有剪切力的影响，最后得到的DNA样品中分子量超过100kb～150kb的很少，但这种大小的DNA足以作为PCR反应的模板和进行Southern blotting分析以及构建以λ噬菌体为载体的基因组DNA文库。从5×107个培养的非整倍体哺乳动物细胞（如HeLa细胞）大约可以制备分子量在100kb～150kb的DNA 200mg，自20ml血液可得250mg。

（二）甲酰胺解聚法

为构建高容量载体的DNA文库和进行分子量巨大的DNA片段的脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分析，需要制备分子量大于200kb的DNA。该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质），然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶和有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可以裂解蛋白质与DNA的复合物，还可使释放的蛋白质变性。但甲酰胺对蛋白酶K的活性无显著影响。本法因操作步骤少，尤其省却了酚的多次提取，所得DNA分子量一般可以大于200kb。

（三）玻棒缠绕法

缠绕法适于同时从不同的细胞或组织标本中提取DNA。与前两个方案不同，它有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀于细胞裂解液与乙醇液的交界面；二是要将沉淀的DNA缠绕于带钩玻棒上。通过带钩玻棒将高分子量DNA沉淀从乙醇溶液中转移到pH8.0的TE溶液重溶。小的DNA片段与RNA不能有效形成凝胶状线卷。该方案以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA分子量只有大约80kb，不能有效构建基因组DNA文库，但用于Southern