核酸的分离与纯化_百替生物(13)

适用于分子克隆中所有常规的酶学反应，也能用于高效的哺乳动物细胞的转染。但PEG法不能有效分离带切口的环状质粒DNA与闭环质粒DNA。

3．柱层析法 柱层析法纯化质粒DNA的关键是其填充的树脂。大体上，树脂可分为两类：一类是利用疏水的相互作用来纯化质粒DNA样品；一类则通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化。以硅基质作为填充材料的柱层析，其作用原理是在多盐条件下，依靠DNA与硅基质的可逆性结合来进行纯化。多盐造成磷酸二酯骨架的脱水，通过暴露的磷酸盐残基，DNA吸附到硅基质上，以50%的乙醇溶液洗去RNA和糖类等生物大分子，然后加入TE或水溶液使DNA分子重新水合，并通过离心洗脱出来。DNA与硅基质的吸附作用与DNA的碱基组成和拓扑结构无关，因此可用于环型质粒DNA和线性DNA的纯化。小于100bp～200bp的DNA分子由于与硅基质的吸附力很弱，不能用于小分子DNA片段的纯化。但在纯化大分子DNA时，可有效去除小分子DNA的污染。

第四节 RNA的分离与纯化

包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。

RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mRNA仅占1%～5%。由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA与mRNA上。

一、RNA制备的条件与环境

为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。

从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的