Primer Premier 5.0中文使用说明书(19)

Primer Premier 5.0中文使用说明书

温度请参看附录A中关于公式的说明选择的Tm范围应该为退火提供足够的热度在自动搜索中PRIMER PREMIER

使用的范围选择机制如下

首先计算出指定搜索范围中所有可能引物的Tm

值

得出平均值后按照不同的严格度要求确定的波动值根据这一平均值来计算出Tm范围

PCR反应的合适Tm范围为56到63°C以上机制是被设根据已发表的实验数据文献

8

计用来保证能在指定的范围内找到合适数量的引物GC%GC

含量

对于PCR反应来说GC含量在50%左右比较合适而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%请参看上文Automatic Search章节中的图表标明的各种搜索方法使用的具体参数Degeneracy

多义性

当设计多义引物时

应尽量减少引物多义性这样会带来更好的特异性应尽量避免

3

末端的多义性因为这里即使一个碱基的错配都能阻止引物延伸详情请参看本说明的Degeneracy多义性章节3’ End Stability3

末端稳定性

引物稳定性影响它的错配效率一条理想的引物应该有一个稳定性较强的

5末端和相对稳定性较弱的

3末端如果引物

3

稳定性强有可能在即使

5末端不配对的情况下造成错而3

末端稳定性低的引物较好的原因是配形成非特异性扩增条带

secondary bands

在引物发生错配时由于3末端不太稳定引物结合不稳定而难以延伸GC ClampGC

钳

引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5末端这一段有较强稳定性的5末端称为GC钳它保证引物与模板的稳定结合选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度使用菜单Report > Internal Stability选项可以看到象下图所显示的

一个引物的内部稳定性曲线表